论文部分内容阅读
目的：构建针对核干细胞因子(nucleostemin, NS)基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)’慢病毒表达载体,并感染人p53缺失型白血病细胞株HL-60,确认其干扰有效后,进行基因芯片实验和后续的生物信息学分析,探讨NS抑制后全基因组表达谱的改变,为进一步探索NS非依赖p53信号通路具体机制奠定基础。方法：(1) NS-siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定：针对NS基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、Age I和EcoR I酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序。将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并感染人白血病细胞株HL-60,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,Real-time PCR检测NS基因的敲减效率。(2)基因芯片实验：以NS-siRNA重组慢病毒感染的HL-60细胞为实验组,阴性对照病毒感染的的HL-60细胞为对照组,提取细胞总RNA,纯化后进行质检,符合要求后后先逆转录为cDNA,并再次转录为带有Cy3标记的cRN A,经纯化后与芯片进行杂交反应,洗涤后进行扫描获取数据,将数据进行标准化和过滤后,以Fold Change≥2或≤0.5作为标准筛选差异表达的基因,并采用Real-time PCR对芯片结果进行验证,然后对差异表达基因行GO分析和Pathway分析,以P<0.05为有统计学意义,且P值越小,表明显著性越强。结果：(1)经测序证实正确构建出了NS基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108TU/m1,荧光显微镜下显示其能有效感染HL-60细胞中,且转染效率在80%以上；Real-time PCR显示转染后NS基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降(P<0.05),抑制率为52.3%。(2)总RNA经检测后,其纯度、完整性和产量满足芯片杂交的要求。经分析后共筛选出1953个差异表达的基因,其中943个基因在实验组中表达上调,1010个基因在实验组中表达下调。Real-time PCR证实了芯片结果数据的可靠性。经分析后,差异表达的的基因可涉及多种功能和信号通路,其中内质网中蛋白质生物通路变化和金属硫蛋白的变化最为显著。结论：(1)成功构建出了NS基因的RNAi’慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60中NS基因的表达。(2)HL-60细胞中NS受到抑制后生物学特性的变化较为复杂,可能涉及到多种功能蛋白、代谢和信号通路,其中上调差异表达基因Pathway分析显示内质网中蛋白质生物通路变化最为显著,而下调差异表达基因Pathway分析显示金属硫蛋白的变化较显著,提示NS抑制后HL-60细胞出现的凋亡可能与内质网压力持续存在诱导的凋亡程序有关,而增殖减弱、致瘤性减弱等变化可能与MT的下调有关,为探索NS在HL-60细胞中非p53依赖信号通路具体机制奠定了基础,但有待后续试验进一步验证。