大肠杆菌O157：H7属于肠出血性大肠杆菌(Enteroheamorrhagic E coli,EHEC),可引起人出血性结肠炎,有时并发溶血性尿路综合症。多年来,曾在美国、日本、加拿大、欧洲等国家和地区多次爆发,造成严重危害,因此,肠出血性大肠杆菌O157:H7为重要的食物源病原菌,其感染成为威胁人类健康的全球性公共安全问题,引起全球极大关注。细菌中的sRNA已被证明是许多基因调控通路中的重要组成部分。细菌进入宿主消化道后,处在适宜的生长环境状况下,并开始在肠道中定植,从周围环境中捕获、整合相关信息,并通过一定的途径传导信息来调控和导致细菌致病毒力基因的表达,从而对宿主造成伤害。其中,在信息传导过程中细菌sRNA起着非常重要的调节作用。对细菌sRNA的作用机制以及其对细菌毒力和致病机制的影响进行研究是目前一个热点问题。本实验靶向细菌小RNA McaS对肠出血性大肠杆菌0157:H7致病力方面的影响。1大肠杆菌O157:H7sRNA McaS缺失株及回补株构建本实验根据大肠杆菌MG511mcaS的基因序列设计一对引物,PCR扩增和克隆了大肠杆菌O157：H7的mcaS基因,通过Red同源重组系统对大肠杆菌O157:H7mcaS基因进行缺失敲除,构建出大肠杆菌O157:H7ΔmcaS缺失株。并通过表达mcaS基因的重组质粒pACYC184-mcaS构建,以及转化入大肠杆菌O157：H7,成功构建出回补株O157:H7ΔmcaS/pmcaS,体外重组表达mcaS基因,为mcaS基因功能的研究提供奠定一定的基础。大肠杆菌0157:H7mcaS基因缺失株具体构建程序为：以质粒pKD3为DNA模板,设计mcaS基因缺失株引物P1、P2, PCR扩增出含氯霉素抗性、且具有和mcaS基因上下游序列同源的融合PCR片段,纯化后电转化入大肠杆菌O157：H7野生株中,在野生株中重组质粒pKD46表达的三种重组酶的共同作用下,融合PCR片段与细菌染色体上mcaS基因发生同源片段重组,基因cat替换目标基因mcaS,在含有氯霉素抗性的LB平板上筛选出mcaS基因缺失且具有氯霉素抗性的阳性重组菌O157:H7ΔmcaS::cat,在此基础上利用质粒pCP20编码的Flp重组酶进行二次重组,去除重组菌携带的氯霉素抗性基因,得到大肠杆菌O157:H7mcaS基因的缺失株O157:H7ΔmcaS。用PCR扩增鉴定和测序检测构建的缺失株0157:H7ΔmcaS,验证缺失株构建成功。以大肠杆菌0157：H7野生株为模板,PCR扩增出mcaS基因序列,在PCR序列两端引入BamH1和SalI两个酶切位点,利用该两个酶切位点将mcaS基因克隆到表达载体pACYC184上,构建重组表达质粒,并转入缺失株O157:H7ΔmcaS,成功构建回补株O157:H7ΔmcaS/pmcaS。运用Red同源重组技术成功构建出0157:H7mcaS基因缺失株和回补株为进一步试验奠定基础。2运用qRT-PCR方法探究基因mcaS缺失后对其上下游基因表达量的影响本实验运用qRT-PCR的方法探究mcaS基因的缺失对其上下游基因表达的影响。其具体步骤为：首先采用Trizol法分别抽提大肠杆菌0157：H7野生株,mcaS基因缺失株以及回补株的总RNA。然后运用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser消除提取产物中可能含有基因组DNA,并对RNA进行反转录以合成cDNA,基于cDNA模板,利用qRT-PCR引物(根据GenBank基因库中发表的大肠杆菌gapA基因,mcaS上下游基因abgR和ydaL的序列设计引物,由Invitrogen公司合成)进行PCR鉴定,鉴定无误后,运用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR检测。结果显示,在野生株、mcaS缺失株以及回补株中,mcaS上下游的基因即abgR和ydaL在RNA水平表达量没有明显变化,排除了由于mcaS基因缺失对上下游基因的影响,为后续试验探究sRNAMcaS的功能排除干扰,提高试验严谨性。3大肠杆菌O157:H7sRNA McaS功能探索分析本试验部分主要从野生株,缺失株和回补株的粘附能力,运动性,群体感应几个方面的性状,比较探究sRNA McaS对细菌的影响,同时,对McaS小RNA在不同细菌间的同源性进行分析。具体过程如下：(一)对运动性的影响,首先通过半固体运动性试验来观察、比较野生株与缺失株的运动环大小变化,发现缺失株的运动明显小于野生株；然后运用荧光定量PCR验证McaS对鞭毛转录的主要调控因子flhD在RNA水平的影响,发现缺失株中flhD基因的表达下降到野生株的56.2%,说明小RNA McaS能够通过上调鞭毛转录主要调控因子flhD的表达,从而影响鞭毛的合成,影响细菌O157：H7的运动能力。(二)对粘附能力的影响,基于Caco-2细胞体外粘附试验,发现缺失株的粘附能力下降野生株的70.8%,而回补株基本恢复野生株的粘附能力；进而利用荧光定量PCR验证McaS对分泌多糖粘附素的孔蛋白编码基因pgaA在RNA水平影响,结果发现：缺失株与野生株相比,pgaA的表达量下降到70.4%;上述结果表明：小RNA McaS可通过上调多糖粘附素孔蛋白的编码基因pgaA,从而影响了细菌0157：H7的粘附能力,基因mcaS缺失后导致其对Caco-2细胞体外粘附能力下降。(三)对群体感应的影响,由于AI-2分子可以诱导报告菌BB170发生生物发光反应,因此通过检测生物发光水平可以定量分析待测菌中AI-2分子表达水平,野生株和缺失株以及回补株中AI-2分子表达水平比较发现,缺失株发出的生物荧光强度较野生株下降了59.9%,而在回补株中得到回复；通过荧光定量PCR发现luxS基因(编码AI-2合成过程中的重要酶分子S-核糖高半胱氨酸酶)在RNA水平的表达量下降到82.1%,结果表明小RNA McaS能在RNA水平上调luxS基因的表达,其缺失后导致luxS基因的表达量下降,从而产生AI-2分子的能力下降,影响了群体感应能力。(四)小RNA McaS在不同细菌间的同源性分析。随机从不同来源的大肠杆菌中挑选菌株K88ac,CE129,3030-2,1194,O157:H7以及番鸭脑膜炎大肠杆菌,分别克隆出mcaS基因序列,测序后发现除了在四处存在点突变(在核苷酸17位A-G突变,103位T-C突变,113位T-G突变,147位A-G突变)外,其他区域存在完全一致,说明小RNA Mcas在猪源(K88ac,3030-2,1194),人源(0157：H7),以及禽源(番鸭脑膜炎,CE129)的大肠杆菌之间存在较高同源性,相对保守。通过上述一系列实验结果表明,小RNA McaS在大肠杆菌0157：H7中,其在细菌的粘附能力,运动力,群体感应中起到一定的调节作用,从而对细菌与宿主的相互作用包括接触感染、粘附以及通过群体感应释放毒素的过程起着重要的促进作用；研究其功能对于致病性大肠杆菌0157：H7具有重要意义,而且在大肠杆菌各亚型中具有较高的同源性,相当保守,为后续探究小RNA McaS对大肠杆菌整体的调控作用具有借鉴和参考的作用。