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目的:探讨川芎嗪(TMP)逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的耐药作用与ROS-MAPK通路的关系。
方法:将人肝癌细胞BEL-7402和BEL-7402/ADM分为以下10组。即:BEL-7402、 BEL-7402/ADM、 BEL-7402/ADM+TMP、BEL-7402/ADM+VRP、 BEL-7402/ADM+3-AT; BEL-7402+ADM、BEL-7402/ADM+ADM、BEL-7402/ADM+TMP+ADM、BEL-7402/ADM+VRP+ADM、BEL-7402/ADM+3-AT+ADM。以TMP作用于人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM，以CCK-8来测定每组细胞经多柔比星（ADM）作用后的IC50值、耐药倍数及逆转倍数;观察抑制率及耐药逆转。并分别联合ROS的诱导剂（3-AT）和MAPK抑制剂(ERK抑制剂UO126、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580)，观察干预前后逆转差异。激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞术(FCM)检测各组细胞细胞内ROS的荧光强度;采用流式细胞仪(FCM)、HPLC技术检测各组细胞细胞内多柔比星蓄积;以流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡情况。
结果:
(1) CCK-8测定结果显示，各耐药组细胞组的IC50值均高于亲本细胞，这表明与亲本细胞相比各耐药组细胞对ADM产生一定的耐药性。其中，与对照组耐药细胞BEL-7402/ADM相比，加入TMP后耐药细胞的耐药倍数降低，逆转倍数提高，这表明TMP对耐药细胞有逆转作用。对于耐药细胞，TMP分别联合ERK抑制剂UO126和JNK抑制剂SP600125后，可降低耐药细胞耐药倍数，升高逆转倍数而逆转耐药。且逆转剂TMP联合JNK阻断剂SP600125后，其耐药倍数明显低于耐药细胞而逆转耐药。但是，逆转剂TMP联合p38抑制剂SB203580作用于耐药细胞后，反而升高了耐药细胞的耐药倍数，使耐药细胞对化疗药物更加不敏感。(2)CLSM和FCM测定细胞内ROS的荧光强度结果显示:与对照组耐药细胞BEL-7402/ADM相比，加入TMP后耐药细胞内的ROS水平得到了提高，且加入化疗药物ADM后细胞内的ROS水平明显升高，这说明了耐药细胞对化疗药物的耐药性与ROS有关。当TMP联合化疗药物ADM后，有升高耐药细胞内的ROS的趋势。(3) FCM测定细胞内多柔比星蓄的积程度结果显示:TMP可使化疗药物ADM在细胞内蓄积。(4) HPLC测定细胞内多柔比星的浓度百分比显示:在相同剂量ADM的情况下，TMP可提高细胞内ADM的含量，这一结果与FCM检测结果一致。(5) FCM检测Annexin V-FITC双标定后各组细胞的细胞凋亡情况表明，加入TMP可使耐药细胞对ADM的敏感性增强而诱导耐药细胞凋亡。
结论:肝癌多药耐药细胞内的ROS水平比亲本细胞下降;细胞耐药和MAPK通路中的ERK、JNK正相关，与p38负相关，但升高细胞内的ROS可使细胞恢复对化疗药物的敏感而逆转细胞耐药。川芎嗪逆转肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM的作用与升高了耐药细胞内的ROS有关。联合MAPK通路中ERK、JNK抑制剂可增强TMP对耐药的逆转。其机制有待进一步研究。