乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。在所有肿瘤中发病率居第二位(11.9%),仅次于肺癌,癌症死亡率居第5位,在女性癌症死亡率中居第一位,全球每年新增170万名新诊断乳腺癌的女性,且发病率呈逐年递增趋势。乳腺癌分子分型包括:Luminal A(ER+,PR+/–,HER2–)(MCF-7,T47D,SUM185)、Luminal B(ER+,PR+/–,HER2+)(BT474,ZR-75)、Basal(ER–,PR–,HER2–EGFR+)(MDA-MB-468,SUM190)、Claudin-low(ER–,PR–,HER2–)(BT549,MDA-MB-231,Hs578T,SUM1315)、HER2(ER–,PR–,HER2+)(SKBR3,MDA-MB-453),其中MDA-231、MCF-7细胞系在实验室应用最为广泛。MCPIP1(Monocyte chemotactic protein induced protein 1)是由zc3h12a基因编码的一类锌指蛋白,属于zc3h12家族,最初被发现在MCP1(monocyte chemotactic protein-1)处理过的人外周血单核细胞中高度表达,在TNF,IL-1β和LPS等细胞因子处理过的巨噬细胞中表达亦有显著增加。MCPIP1全长599个氨基酸,有6个外显子,具有RNA酶活性,通过与3‘UTR(Untranslated region)结合进而促进某些炎症因子(如IL-1,IL-6和IL-12)的降解。MCPIP1还有抑制T细胞活化的作用,被认为是炎症和内环境平衡调节的关键分子。MCPIP1通过降解病毒RNA起到抗病毒感染的作用。最新的研究显示MCPIP1可以通过诱导细胞凋亡来抑制乳腺癌细胞增殖,其机制是调节促凋亡和抗凋亡相关基因mRNA表达水平。MALT1((Mucosa Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Gene 1),全称黏膜相关淋巴瘤易位基因1,在30%的MALT(黏膜相关淋巴组织)淋巴瘤中可见表达。MALT1可与CRAM1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1)和BCL-10结合形成CBM(CARMA1/Bcl10/MALT1)复合物,激活Ikk(IκB kinase),引起IκB(Inhibitor ofκB)降解,激活NF-κB信号通路.有研究报道在TCR(T cell receptor)刺激下,T细胞内的MALT1可于R111位点降解mcpip1,解除mcpip1对t细胞的抑制作用,引起t细胞活化。在弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma)和粘膜转移相关性淋巴瘤中malt1作为肿瘤生长促进因子已经得到证实。提示malt1可作为淋巴瘤治疗的用药靶点,有研究报道使用malt1抑制剂mi-2和mepazine可有效抑制abc-dlbcl细胞增殖,此作用在体外和体内实验均得到证实。但malt1抑制剂对乳腺癌细胞的作用尚未见相关报道,有研究报道在乳腺癌细胞中敲低malt1表达能够增强顺铂诱导的细胞凋亡。因此本研究从以下三方面研究1.通过检测乳腺癌细胞系内malt1表达水平和分析乳腺癌患者malt1表达水平和预期生存的关系,确定malt1对乳腺癌细胞增殖和乳腺癌患者预后的临床意义.2.使用malt1抑制剂处理乳腺癌细胞,确定malt1抑制剂对乳腺癌细胞增殖的影响及相关机制,并使用mcpipi1knockdown细胞研究malt1抑制剂抑制乳腺癌细胞增殖的过程中是否有mcpipi参与。3.使用nsg小鼠制作乳腺癌小鼠模型,并予mepazine治疗,明确mepazine在体内实验中对乳腺癌细胞的作用,为临床应用提供可靠证据。第一部分malt1在乳腺癌细胞中的表达研究目的:mcpip1是最新发现的一种乳腺癌细胞抑制蛋白,通过调节促凋亡基因和抗凋亡相关基因的mrna水平诱导乳腺癌细胞凋亡,进而抑制乳腺癌细胞增殖,研究报道mcpip1在乳腺癌细胞中的表达高于正常乳腺上皮细胞,在乳腺癌患者的肿瘤组织中表达水平同样高于周围正常组织,且mcpip1与乳腺癌患者的预后呈正相关性,表达水平越高,预后越好。malt1具有蛋白酶活性,可引起mcpip1降解,检测malt1在乳腺癌细胞系和病人组织中的表达水平,探讨malt1对乳腺癌细胞的增殖以及对乳腺癌病人预后的影响。方法:1研究细胞系1.1人乳腺上皮正常细胞mcf-10a、mcf-12a人乳腺癌细胞系mda-231、mcf-7、t47d、mda-4531.2小鼠乳腺上皮正常细胞fsk4小鼠乳腺癌细胞系4t1tsa1.3人肝脏正常细胞ihh人肝癌细胞系h7、h7.51.4人前列腺上皮正常细胞hpv7人前列腺癌细胞du1451.5人肺脏上皮正常细胞mrc-5人肺癌细胞系h232q-pcr检测:trizol法提取正常细胞及肿瘤细胞系rna,研磨乳腺癌病人肿瘤组织及周围正常组织并提取rna,紫外分光光度计定量,做逆转录及q-pcr以检测mrna表达水平。3western检测:ripa裂解提取正常及肿瘤细胞系蛋白做western以检测malt1蛋白表达水平。4生存曲线分析:通过266例病人的数据库分析malt1的表达水平跟病人预后的相关性。根据肿瘤恶性程度分为gradeⅠ、gradeⅡ、gradeⅢ三组并比较malt1表达水平;根据malt1表达水平将266例病人分为高表达组和低表达组,并做生存曲线分析。根据免疫组化分型分为er+、pr+、her2+三组,比较malt1表达水平,并做生存曲线分析。结果:1.q-pcr:malt1在人乳腺癌细胞系、小鼠乳腺癌细胞系、人肺癌细胞系中mrna表达水平均低于正常细胞系。2.western结果:malt1在人乳腺癌细胞系、小鼠乳腺癌细胞系、人前列腺癌细胞系、人肺癌细胞系中蛋白表达水平均高于正常细胞系。在人肝癌细胞系中malt1表达水平与正常细胞无明显差别。3.生存曲线分析:gradeⅢ组中malt1表达水平高于gradeⅠ、gradeⅡ,gradeⅠ、gradeⅡ两组间malt1表达水平无明显差异;malt1高表达组病人预后较低表达组要差。her2+组malt1表达水平高于er+、pr+两组,预后较er+、pr+两组要差,er+、pr+两组之间malt1表达水平及预后无明显差别。结论:1malt1的蛋白表达在多种肿瘤细胞系中高于对应正常细胞系。2malt1表达水平与乳腺癌病人预后呈负相关性,表达越高,预后越差。第二部分malt1抑制剂对乳腺癌细胞作用的机制研究。目的:malt1在abc-dlbcl(activatedbcell-likediffuselargebcelllymphoma)中高表达,在弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma)和粘膜转移相关性淋巴瘤(maltlymphoma)中malt1作为肿瘤生长促进因子已经得到证实,研究发现malt1抑制剂mi-2(malt1inhibitor2)和mepazine可通过抑制nf-kb(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedbcells)活性、引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的作用来有效抑制abc-dlbcl增殖,但malt1抑制剂在乳腺癌细胞中作用未见报道。第一部分研究已证实malt1在乳腺癌细胞中高表达且与乳腺癌患者预后相关,分析malt1抑制剂对于乳腺癌细胞的作用,旨在为乳腺癌的治疗寻找新的靶点,拓展新的思路,使用mcpip1knockdown细胞探究mcpip1是否参与malt1对乳腺癌细胞的抑制作用,进一步明确malt1抑制剂的作用机制。方法:1研究细胞系:mda-231、mcf-7人乳腺癌细胞系。mcf-10a人乳腺正常细胞系;4t1、tsa小鼠乳腺癌细胞系,fsk4小鼠乳腺正常上皮细胞。mda-231tet-on细胞;mda-231mcpip1knock-down细胞系及相应scramble对照细胞系。2mtt分析和细胞计数:选用不同浓度mi-2和mepazine处理mcf-1oa、mda-231mcf-7细胞,并于不同时间点做mtt分析和细胞计数,确定malt1抑制剂对乳腺癌细胞增殖的作用以及mcpip1是否参与此过程。3pi法细胞周期分析:选用不同浓度mi-2和mepazine处理mda-231、mcf-7细胞,并于不同时间点收集细胞以pi染色,分析细胞周期,确定malt1抑制剂对细胞周期的作用。4q-pcr检测:选用不同浓度mi-2和mepazine处理mda-231、mcf-7细胞,并于24小时以trizol法收集rna做逆转录及q-pcr检测细胞周期相关基因的表达。5细胞凋亡分析:选用不同浓度mi-2和mepazine处理mda-231、mcf-7细胞,收集蛋白以western检测凋亡相关蛋白parp1表达,收集细胞用annexinv—fitc和pi(propidiumiodide)染色,做流式细胞学分析,观测凋亡细胞比例。6nf-κb活性分析:选用不同浓度mi-2和mepazine处理mda-231、mcf-7细胞,72小时后收集核、浆蛋白检测细胞核中nf-κb的表达。7luciferase活性检测:将含有nf-κb、cdk2、cdk63’utrluciferasereporter电转染mda-231和mcf-7细胞,转染后24小时加mi-2,48小时后检测luciferase活性,确定mi-2对nf-κb活性及cdk2、cdk63’utr活性的影响。8western分析:选用mi-2和mepazine处理mda-231、mcf-7细胞并提取蛋白,检测malt1抑制剂对乳腺癌细胞内mcpip1表达的影响。对mda-231tet-on细胞,加dox(doxycycline100ng/ml)刺激24小时,诱导gfp-mcpip1表达,然后加mi-2和mepazine处理72小时并收集蛋白做western分析,确定malt1抑制剂对细胞内malt-1对mcpip1裂解作用的影响。9mrna半衰期检测选用mi-2处理mda-231细胞24小时后加actinomycind(actd)和5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosylbenzimidazole(drb)阻断转录,并于加药后不同时间点收集rna,检测mrna表达水平,绘制半衰期曲线,计算并比较处理组与对照组半衰期。10malt-1抑制剂与mcpip1相关性试验。使用不同浓度mi-2和mepazine处理mda-231mcpip1knock-down及mda-231scramble对照细胞系,并做以下实验:10.1在不同时间点做mtt实验确定knockdownmcpip1是否影响mi-2/mepazine对细胞的抑制率。10.2收集细胞以pi法检测细胞周期;10.3trizol法收集rna做逆转录及q-pcr检测细胞周期相关基因表达。10.4ripa裂解收集蛋白检测细胞凋亡相关蛋白的表达10.5annexinv—fitc/pi检测凋亡细胞比例结果:1mtt分析和细胞计数:mi-2和mepazine能有效抑制mda-231和mcf-7细胞增殖,且作用呈浓度依赖和时间依赖。mda-231和mcf-7细胞相对于mcf-10a细胞对malt1抑制剂更加敏感。2细胞周期分析:mi-2和mepazine均能显著引起mda-231和mcf-7细胞周期阻滞在g1期。同时引起细胞周期g1相关基因cdk2、cdk4、cdk6表达降低,半衰期缩短。3细胞凋亡分析:mi-2对乳腺癌细胞不能诱导明显凋亡。mepazine可以诱导细胞凋亡在乳腺癌细胞,且作用呈浓度依赖。4nf-κb活性分析:经mepazine处理的乳腺癌细胞核内nf-Κb家族成员p65、c-rel表达减弱,p65、c-rel的mrna表达水平降低。5luciferase活性分析:经mi-2处理的mda-231细胞中nf-κb、cdk23’utr、cdk63’utr的活性明显低于对照组。6western分析:malt1抑制剂可增加细胞内mcpip1表达,在mda-231te-on处理组中观测到细胞内mcpip1的裂解减少。7半衰期实验:mi-2处理组中cdk2、cdk4的半衰期明显短于对照组。8mcpip1与malt1抑制剂相关性实验8.1mtt结果mi-2和mepazine对mda-231mcpip1knockdown细胞的抑制率明显低于scramble细胞8.2细胞周期结果在mda-231mcpip1knockdown中mi-2和mepazine引起细胞周期在g1期阻滞作用弱于scramble细胞。8.3q-pcr结果在mda-231mcpip1knockdown细胞中mi-2/mepazine对细胞周期相关基因cdk2、cdk4、cdk6的调节作用弱于scramble细胞。8.4western及流式结果经mepazine处理的mda-231mcpip1knockdown细胞中早期凋亡细胞比例及凋亡蛋白cleaved-papp1的表达明显低于mda-231scramble处理组。结论:1malt1抑制剂可显著抑制乳腺癌细胞增殖且此作用呈浓度依赖性和时间依赖性,正常乳腺上皮细胞对malt1抑制剂的敏感性弱于乳腺肿瘤细胞。2malt1抑制剂通过降低细胞周期相关基因mrna的稳定性进而引起细胞周期阻滞在g1期。3malt1抑制剂阻断nf-κb由胞浆向核内转运过程且影响p65、c-rel的表达。4malt1抑制剂增加细胞内mcpip1表达通过抑制malt对mcpip1的降解作用。5 MALT1抑制剂对乳腺癌细胞的抑制作用有MCPIP1参与。.6 MALT1抑制剂引起细胞周期阻滞和调节细胞周期相关基因表达的作用有MCPIP1参与。7 MEPAZINE诱导乳腺癌细胞凋亡的作用部分通过MCPIP1。第三部分MALT1抑制剂的体内实验。目的:研究报道MALT1抑制剂对于ABC-DLBCL的抑制作用在体内实验中得到证实,但是MALT1抑制剂对于实体瘤的作用未见报道。通过MALT1抑制剂对乳腺癌细胞的体内实验,确定其在乳腺癌临床治疗中的应用前景。方法:1研究对象:NSG(NOD-SCID IL-2receptor gamma null)小鼠2分组及给药方法:6只NSG小鼠随机分为对照与给药组,每只小鼠腹部双侧乳腺部位注射MDA-231细胞。于注射第40天时开始给药,给药组予腹腔注射MEPAZINE(800μg/只),对照组予腹腔注射2%DMSO,每24小时给药一次,共计给药10次。3测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,取出肿瘤拍照并称重,提取肿瘤组织蛋白及RNA并检测凋亡相关蛋白及细胞周期相关mRNA表达.4肿瘤组织切片并做HE染色结果:1治疗组肿瘤体积及重量明显小于对照组。2治疗组中凋亡信号蛋白PARP-1及MCPIP1表达高于对照组,细胞周期相关基因CDK2、CDK4、CDK6表达低于对照组。3 HE染色:对照组切片镜下观察可见组织结构完整,细胞边缘清晰,治疗组组织结构被明显破坏,细胞形态改变。结论:1 MEPAZINE在小鼠体内可明显抑制乳腺癌细胞增殖。2 MEPAZINE在小鼠体内抑制乳腺癌细胞增殖通过诱导细胞凋亡、引起细胞周期阻滞和诱导MCPIP1表达来实现。