新生隐球菌是一种环境致病菌,在艾滋病患者和CD4+T细胞缺陷者中常见,易导致隐球菌脑膜炎。艾滋病感染患者中每年有100万人新增隐球菌患者,大约有62.5万人死于隐球菌脑膜炎相关疾病。37℃生长,荚膜,黑色素,尿素酶等是目前已知的新生隐球菌的毒力因子。研究新生隐球菌的毒力因子以及它们之间如何相互作用,对于控制隐球菌感染的蔓延具有重要意义。丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶是常见的蛋白水解酶类,广泛的分布在自然界的生物中,包括病毒、细菌、真菌和动植物。天冬氨酸蛋白酶参与很多重要生理过程。在动物中,肾素是一种天冬氨酸蛋白酶,其可以通过肾素-血管紧张素系统调节血压;逆转录病毒天冬氨酸蛋白酶,如HIV蛋白酶,是病毒颗粒的成熟必不可少的,其抑制剂是治疗AIDS成熟的药物;白色念珠菌分泌的天冬氨酸蛋白酶参与粘附过程和组织的渗透,并与宿主的免疫系统的相互作用。丝氨酸蛋白酶的生理功能包括血液凝结,细胞和体液免疫,纤维蛋白溶解,受精,胚胎发育,蛋白质加工和组织。在皮肤癣菌中,丝氨酸蛋白酶可能参与皮肤癣菌对宿主的粘附过程。新生隐球菌蛋白酶被认为是隐球菌的潜在毒力因子,但是其在隐球菌感染中的作用和地位还未明确。目前已有隐球菌外分泌的蛋白酶被鉴定和分离出来。最近的研究表明隐球菌的一种金属蛋白酶Mpr1在隐球菌通过血脑屏障过程中扮演着重要的角色。新生隐球菌丝氨酸蛋白酶被证实可以分解纤维连接蛋白,可能在隐球菌通过血脑屏障中发挥作用。在本文的研究中,我们首先通过转录组测序比较了新生隐球菌在体内脑脊液,体外脑脊液及体外YPD转录组表达的不同,结合MEROPS数据库,筛选出可能在新生隐球菌感染中发挥作用的6个丝氨酸蛋白酶编码基因和5个天冬氨酸蛋白酶编码基因。为了研究这11个基因在隐球菌感染中的作用,我们通过Cre-Lox P系统构建了天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的单基因和多基因缺陷株:ser1△,ser2△,ser3△,ser4△,ser5△,ser6△,ser M2△,ser M3△,ser M4△,ser M5△,ser M5△+SER3,ser M5△+SER5,asp1△,asp2△,asp3△,asp4△,asp5△,asp M2△,asp M3△,asp M4△,asp M5△。通过体外的应激应答实验,我们发现天冬氨酸蛋白酶缺陷株的表型缺陷并不明显,于是我们将焦点集中在丝氨酸蛋白酶。我们发现丝氨酸蛋白酶Ser5参与新生隐球菌黑色素的诱导和生成。ser M5△多基因缺陷株对体外细胞壁压力敏感,其基因缺陷可能影响细胞壁的完整性,同时ser M5△表现出尿素酶活性和蛋白酶活性下降。但是长时间的培养显示ser M5△并没有完全丢失尿素酶和蛋白酶活性。在小鼠尾静脉感染中,ser M5△在脑部的菌荷量显著下降,可能与其通过血脑屏障障碍有关。在小鼠吸入模型中,ser M5△感染小鼠的生存率并没有明显的延长,可能与ser M5?并没有完全丢失蛋白酶活性相关。本实验对天冬氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶的相关基因进行了一个宏观的筛查,并对感兴趣的基因进行了表性和毒力的检测,试图探讨新生隐球菌特定蛋白酶与隐球菌致病能力的关系,但是其深入的分子细胞机制还需要在以后的研究中探讨。