研究背景：恶性黑色素瘤(malignant melanoma MM)是由异常黑素细胞过度增生引发的常见皮肤肿瘤,其发病率随人种、地域、种族的不同而有所差异,白种人的发病率远较黑种人高,居住在澳大利亚昆士兰州的白种人其发病率高达17/10万。我国虽属低发地区,但近年来发病率却呈倍数增长,据统计,2000至今每年新发病例约2万人,MM已经成为严重危害我国人民健康的疾病之一。MM多为原发,但长期的色素性皮损恶变为黑色素瘤临床并不少见,外伤、反复摩擦,激光、冷冻、化学腐蚀剂消痣术导致恶变也时有所见。MM可表现为皮肤结节状或辐射性生长病灶。可为棕黄色、棕色、蓝色、桃红色、黑色,正常皮肤纹理消失,边缘可呈锯齿状,病变可呈局部隆起,继发溃疡,渗出出血,疼痛,晚期可出现卫星结节。下列几种情况常提示色素性皮损早期恶变：颜色改变；边缘参差不齐；病灶隆起；短期快速增大；表面不光滑、脱屑、渗液、出血；局部疼痛。近几十年全球MM的发病率持续增加。其在男性恶性疾病中增长最快,在女性中仅次于肺痛,年增长率为3-5%。 MM在男性和女性恶性疾病中分别占第5位和第6位,根据死亡风险来说仅次于成人白血病。中位发病年龄为45-55岁。发生MM的高危因素包括明确的家族史,黑色素痛病史,多发非典型痣或发育不良痣和先天基因突变。除外内因,阳光暴晒也可能对黑色素瘤的发生发展起推动作用。皮肤容易被晒伤且皮肤白皙的个体的患病风险更高。然而黑色素瘤也发生于任何人种和未接受过大量阳光暴晒的人群。MM在我国发病率较低,但近年来成倍增长。2000年发病率统计仅为0.2/10万,2005-2007年约为1/10万,每年新发病例约2万人。因此MM已经成为严重危害我国人民健康的疾病之一。我国黑色素痛发病率增高主要有以下几个原因：(1)滥用雌激素类药物；(2)免陷缺陷；(3)大气污染；(4)化学性皮肤污染；(5)知识缺乏,对该病不够重视。进展期的MM死亡率较高,肿痛厚度<0.75mm的患者正确治疗后长期存活率可达90-95%,一旦厚度超过4mm,5年生存率有30%左右。目前对进展期MM的进行有效治疗仍相当困难。我国虽为MM的低发地区,但大多数患者确诊时已为时较晚,因此如何对MM进行正确的早期诊断与制定个体化的综合治疗方案是急需解决的问题。澳大利亚国家健康与医学研究理事会(Australian Government National Health and Medical Research Council NHMRC)针对MM的诊断更是提出“早期诊断即为挽救生命”的口号。临床上肿瘤呈黑色或黄褐色,亦可呈淡红色,息肉状,基底常较广,大小不等。MM可表现出多种不同的大体及组织学形态。原发性MM常见的组织学类型包括浅表扩散型,结节型,恶性雀斑样,肢端雀斑样；少见类型有上皮样,促纤维增生性,恶性无色素痣等。因为上述所有类型可能并无色素,所以这类病例诊断比较困难,免疫组化和细胞遗传学的分析对于MM正确诊断相当重要。在MM诊断中,病理学检查是其确诊甚至分期的最终标准。免疫组化是指导性的检测手段,同时也可用于预后的评判。S-100、HMB45和波型蛋白(Vimentin)是诊断MM的较特异指标。S-100蛋白是诊断MM的良好标记物,敏感性强,但特异性差,故常与其他标记物合用,如HMB45,94.7%的MM均表达S-100蛋白,其存在于各种类型的黑色素痣和黑色素瘤内。HMB45敏感性不及S100,但其在MM诊断中更具特异性。Vimentin在恶性黑色素瘤中有较高的表达率,有报道Vimentin在皮肤MM的阳性表达率可达100%,但Vimentin对MM缺乏特异性,大多数肉瘤及一些低分化痛也可表达,因此Vimentin要与其他抗体如HMIM5、S-100蛋白结合使用。近年随着分子生物学特征、临床组织学特征和基因突变之间的关系研究不断深入,发现特定类型与特定基因变异相关,新的分类法更有利于临床应用,目前国际上倾向于将黑色素痛分为四类：肢端型、黏膜型、慢性日光损伤型、非慢性日光损伤型。全世界MM病例的数量增幅远远快于其他恶性肿瘤。其有着快速的转移性、对治疗的抵抗性和较高的死亡率等特征,其预后与多项临床因素、分子生物学指标及基因表达相关。目前普遍认为与其预后相关的因素包括有年龄、肿瘤厚度、原发病灶是否溃疡、病灶切缘情况、Clark分级、AJCC临床分期、有丝分裂率(Mitotic rate MR)、前哨淋巴结(sentinel lymph node SLN)是否转移、LDH值。近年许多研究都在探究对MM形态学以外的有预后意义的辅助指标,包括有突变型p53蛋白、Ki-67、增殖细胞核抗原、Ki-S5、热休克蛋白、bcl-2蛋白,cyclinD1、cyclinD3等。已证实有大量的蛋白分子,癌基因、抑癌基因或其他基因参与MM的发生、发展和侵袭转移,但其机制还远未彻底阐明。2011版的中国黑色素瘤诊断指南新增了KIT基因和BRAF基因突变为皮肤MM独立预后不良因素,KIT基因突变为粘膜MM的独立预后不良因素。但由于基因检测技术有一定临床限制性,目前诸多研究致力于用蛋白质组学的方法检测与MM肿瘤生长、转移有关的分子标志物。S100蛋白是一组低分子量的钙结合蛋白,其21KD部分在中枢神经系统的胶质细胞中首次被检测出来,1981年,Gaynor等发现在人黑色素瘤细胞中也存在S-100蛋白,使其成为一个广泛运用的诊断性指标。S100有两种亚单位α和β产生三种二聚体。不同的S100蛋白含有类似的氨基酸结构域,在氨基端和羧基端均含有疏水区,在每个亚基的羧基端均含有1个EF手型钙离子结合区,当与钙离子结合后,S100蛋白构象发生改变,暴露出其与靶蛋白的结合位点,进而通过与相应的靶蛋白作用发挥其生物学效应。S-100蛋白敏感性高,但缺乏特异性,除黑素细胞以外,Schwann细胞、肌上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、组织细胞以及郎格汉斯细胞(Langerhans cell)均呈阳性。因此其用于MM诊断需结合其他特异性较高的指标,如HMB46。已有相关文献报道在Ⅱb/Ⅲ期患者中S100B的高表达与其不良预后明显相关,S-100B可以作为一个预后指标用来预测Ⅲ期患者的治疗效果；还有相关研究表明S100A13可能是MM的血管源性分子标记物。Vimentin又名波形蛋白,其C端尾部特异结合细胞核外膜,N端头部结合细胞膜,故在细胞核和细胞膜之间形成联接。维持细胞结构和形态的细胞骨架由一系列复杂的结构蛋白组成,包括微管、微丝和中间丝(intermediate filament, IF)。 Vimentin是存在于间充质细胞中的一种中间丝蛋白,属于Ⅲ型IF,表达在间充质细胞和一些外胚层细胞,如成纤维细胞和内皮细胞高丰度表达,常在分化特异性的中间丝蛋白,如肌间线蛋白和神经丝蛋白表达和整合前形成支撑网络。因Vimentin有蛋白激酶C和蛋白激酶A磷酸化位点,通过磷酸化与去磷酸化,细胞可改变不溶解的中间丝网络,且Vimentin有调节细胞骨架蛋白、细胞粘附分子等蛋白间的相互作用,同时参与肿瘤细胞和肿瘤相关内皮细胞、巨噬细胞的粘附、迁移、侵袭和细胞信号转导。故其高度动态的聚合解聚间的平衡和其复杂的磷酸化形式可能是Vimentin参与肿痛转移过程及细胞-细胞间相互作用的调节机制。近些年研究显示Vimentin与肿瘤发生、转移密切相关,且在间质来源肿瘤细胞显示阳性,在上皮来源肿瘤显示阴性,故此表明,Vimentin阳性提示肿瘤恶性发生的上皮间质化,且在侵袭性肿瘤细胞系中的表达显著升高,且其表达与肿瘤恶性程度及预后呈现正相关。已有国外研究报道Vimentin蛋白表达水平与MM血行转移相关,可影响患者的预后。HMB45是一种抗恶性黑素瘤的单克隆抗体,能识别前黑素小体球蛋白,可与不成熟的黑素细胞及黑素瘤细胞起反应,在恶性黑素瘤的诊断中具有较高特异性。但其敏感性较低,即对表皮的恶性黑素瘤细胞呈强阳性,对真皮、软组织及淋巴结内恶性黑素瘤细胞具有较高的弱阳性或阴性率。尤其是梭形细胞黑素瘤及促纤维生成性黑素瘤几乎不表达。无色素型恶性黑色素瘤组织中HMB45阳性表达率高,免疫标记有助于无色素性病例的确诊和鉴别诊断。其与MM预后是否相关尚未见报道。至目前为止,有关能影响MM患者预后的形态学因子及分子生物学指标的研究结果尚未达成明确共识。目的：经过几十年的研究,MM患者的预后有了很大程度上的进步,但总体而言其预后仍然较差,特别是进展期及术后复发的患者,其中位生存期不到1年。因而探讨与MM预后相关的因素就显得尤为重要。之前的研究普遍认为与MM预后有关的因素仅仅限于各项形态学指标。近年来分子生物学指标与肿瘤预后的关系日益受到人们的重视,已有研究揭示了S-100、Vimentin等蛋白表达与肿瘤转移及预后的关系。但也有文献报道其对MM患者的预后估计作用不大,其是否能影响疾病的分期,从而指导有效的个体化治疗方案的制定还有待研究探讨。本实验研究对南方医院2001年1月～2011年12月手术切除的MM标本127例进行随访,并收集相关临床及病理资料。采用免疫组化SP法检测病灶组织中S-100、Vimentin及HMB45蛋白表达水平。探讨各种临床因素及分子生物学指标与MM预后的关系。方法：1.收集资料收集我院2001年1月～2011年12月手术切除的MM标本127例,并经病理学证实为MM。并对其进行预后随访,生存期的计算从患者接受手术之日起至死亡或2011年11月末次随访日止,至末次随访日仍存活者生存时间定为删失值。2.整理临床资料及数据127例患者的临床资料按年龄、性别、肿痛发生部位、是否溃疡、手术切缘情况、Clark分级、AJCC (?)临床分期、初诊淋巴结是否转移及转移数目、治疗方法及疗效分组。3.统计学分析使用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采用寿命表法计算生存率,应用Kaplan-Meier法绘制累计生存率曲线,Log-rank检验进行生存曲线之间的比较,Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素回归分析,P<0.05认为具有统计学意义。1.免疫组化方法：本实验采用免疫组织化学SP法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法)2.统计学方法使用SPSS13.0统计软件进行统计分析,采用寿命表法计算生存率,应用Kaplan-Meier法绘制累计生存率曲线,Log-rank检验进行生存曲线之间的比较,Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素回归分析,P<0.05认为具有统计学意义。结果：1.生存情况全组病例均获得完整随访,随访时间为1-138个月,中位随访时间36.00个月,随访期间死亡72例(56.7%)。127例MM患者中位存活时间为36.00个月,1年、3年和5年生存率分别为79%、50%和40%。2.单因素COX回归分析结果本研究中,影响MM预后以死亡为标准。单因素分析结果显示,临床因素包括年龄、是否溃疡、Clark分级、术后切缘情况、AJCC临床分期、治疗方法及疗效与预后相关(P<0.05),而性别、肿瘤发生部位、淋巴结是否转移及转移数目与预后不相关(P>0.05)3.多因素COX逐步回归分析结果多因素逐步分析结果表明年龄、Clark分级、术后切缘情况及疗效是MM的独立预后影响因素。1.免疫组化SP法检测HMB45、S-100以及Vimentin在MM病灶组织中的表达。127例MM组织标本中,13例HMB45蛋白表达为阴性(-),82例为弱阳性(+),22例为中等阳性(++),10例为强阳性(+++)；10例S-100蛋白表达为阴性(-),57例为弱阳性(+),35例为中等阳性(++),25例为强阳性(+++)28例Vimentin蛋白表达为阴性(-),80例为弱阳性(+),11例为中等阳性(++),8例为强阳性(+++)；HMB45、S-100以及Vimentin在127例MM中的阳性表达率分别为89.8%、92.1%和78.0%。2.本研究中,影响MM预后以死亡为标准。单因素分析结果显示,S-100蛋白表达水平与预后相关(P<0.05),而HMB45和Vimentin蛋白表达水平与预后不相关(P>0.05)。3.多因素逐步分析结果表明,S-100蛋白表达水平是MM的独立预后影响因素。结论：1.本研究127例MM患者中位存活时间为36.00个月,1年、3年和5年生存率分别为79%、50%和40%,表明MM患者的预后仍然较差。2.临床因素与预后关系的研究：本研究中影响MM预后的因素包括年龄、是否溃疡、Clark分级、术后切缘情况、AJCC临床分期、治疗方法及疗效,其中n年龄、Clark分级、病灶切缘情况与疗效是独立预后影响因子；而性别、肿瘤发生部位、淋巴结是否转移及转移数目与预后不相关。3.分子生物学标记物与预后关系的研究：HMB45、S-100以及Vimentin在127例MM中的阳性表达率分别为89.8%、92.1%和78.0%。表明其对MM早期诊断有重要意义。统计学分析结果显示,S-100蛋白表达水平与预后相关,且为独立预后影响因子。而HMB45和Vimentin蛋白表达水平与预后不相关。4.关于MM的分期标准：在过去,评估MM分期的指标仅仅限于组织学指标(肿痛厚度及溃疡,淋巴结转移等)。随着分子生物学技术及基因技术的发展,诸多蛋白标记物及基因指标皆被用来更全面更准确地对肿瘤进行分期。目前,AJCC分期中唯一用到的血清学指标是LDH水平。已有诸多研究表明S-100蛋白的表达水平较LDH对MM预后的评估更有特异性和灵敏度。本研究证实了S-100蛋白水平与预后的相关性。5.关于MM的治疗MM是一种高度恶性,易转移,预后差,对化疗放疗均不敏感的恶性肿瘤,随着肿瘤免疫学,分子生物学技术的迅速发展,过继免疫治疗、生物化学治疗、肿瘤疫苗、靶向等治疗MM的方法显示了良好的应用前景。针对MM患者目前多主张采取多学科综合治疗模式。免疫治疗成为主要的辅助治疗手段。NCCN指南推荐1年高剂量a-2b干扰素辅助治疗主要适应人群为Ⅱb期以上(含Ⅱb期)的高危术后患者。Ⅳ期或者不能手术切除的患者治疗在近两年获得突破性进展,NCCN在2011年引入了Ipillimumab(抗CTLA-4单抗)列为标准治疗。针对免疫治疗明显的毒副作用,可以检测相关分子标记物水平,结合临床因素选择合适的患者行辅助治疗以获得更大的有效率。