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背景:卒中是导致人类死亡的主要疾病之一,是疾病致残的首位病因。缺血性卒中是卒中的主要类型。尽管国内外学者进行了大量的研究,目前仍无肯定有效的神经保护剂投入临床治疗缺血性卒中,迫切需要探索新的神经保护途径。腺苷是中枢神经系统重要的神经调质,目前已克隆出4种腺苷特异性受体亚型,即A1、A2A、A2B及A3受体。腺苷参与调节脑内重要的生理功能。腺苷活动异常与某些神经系统疾病的发生和发展有关,对其干预可能阻止或逆转疾病过程。以往动物实验发现腺苷A2A受体拮抗剂对神经元缺血性损伤具有保护作用,但确切的作用环节和机制仍不明确,有必要进一步探讨。众所周知,在急性脑缺血发生后,缺血性脑损害的发展将经历多个阶段,其中主要包括急性期损害、再灌注损害和脑水肿。脑缺血数分钟后,随着细胞能量耗竭,引起细胞酸中毒、细胞膜功能和结构损害,发生早期神经损伤。脑缺血诱发脑内谷氨酸过度释放,谷氨酸通过激活NMDA受体使细胞外钙离子内流,并促进细胞内储存钙释放,导致细胞内游离钙增加,由此激活细胞内脂酶和蛋白酶,破坏细胞骨架结构,并引发系列信号级联反应。研究证实,位于谷氨酸能神经元突触前的A2A受体被激活后,可以促进谷氨酸的释放。因此,推测脑缺血后腺苷A2A受体的激活可能由于促进谷氨酸的释放而加重了钙超载。再灌注后随着组织血流恢复,大量氧自由基产生,炎性介质表达增加,造成细胞膜结构损伤和DNA断裂,多种机制共同作用引起再灌注损伤、血脑屏障破坏和脑水肿形成。脑水肿是脑缺血后再灌注损伤的重要病理环节,可引起和加重迟发性神经元损伤。实验发现,水通道蛋白4(Aquaporin,AQP4)在缺血性卒中后表达增高,与脑水肿形成一致。研究证实,位于血管内皮细胞和平滑肌细胞的A2A受体被激活后能扩张脑血管。由此推测脑缺血后再灌注阶段A2A受体的激活可能由于扩张脑血管而加重脑水肿。尽管以往动物实验研究发现阻断腺苷A2A受体能够减轻缺血性脑损伤,但由于对组织病理损害的观察时点仅限于再灌注后,也无对脑水肿影响的研究报道,因此难以清楚解释阻断腺苷A2A受体减轻缺血性脑损伤的可能作用环节和机制。因此有必要进一步探讨阻断A2A受体对脑缺血后不同时相、不同类型病理损伤的影响。目的:本研究利用腺苷A2A受体基因敲除小鼠建立大脑中动脉缺血/再灌注模型,针对急性缺血性脑损伤不同时相和病理损伤类型,初步探讨阻断A2A受体对于缺血性脑损伤保护效应的作用环节,期望为解释其保护作用机制提供线索。方法:1.腺苷A2A受体基因敲除(A2ARKO)小鼠及同窝野生型(A2ARWT)小鼠各分为脑缺血2h组、脑缺血后再灌注22h组和脑缺血后再灌注46h组。2.线栓法制作大脑中动脉阻塞模型。3.脑组织切片甲酚紫染色结合图象分析技术测定脑梗死体积。4.干湿重法测定脑组织含水量。5.免疫组化染色检测钙结合蛋白(Calbindin D-28k,CB)和水通道蛋白4。结果:1.在脑缺血2h、脑缺血后再灌注22h和脑缺血后再灌注46h,测定A2ARKO组的脑梗死体积均显著小于A2ARWT组的梗死体积(P<0.01)2.光镜下见钙结合蛋白免疫反应阳性物质位于神经元细胞浆,免疫反应阳性细胞主要分布于海马和皮质,在梗死灶周边区计数阳性细胞并做组间比较。脑缺血2h,与假手术组比较,A2ARWT组钙结合蛋白免疫反应阳性细胞显著较少(P<0.01),而A2ARKO组无显著差异(P>0.05)。脑缺血后再灌注22h和46h,与假手术组比较,A2ARKO组和A2ARWT组钙结合蛋白免疫反应阳性细胞均显著较少(P<0.05,P<0.01)。在脑缺血后各时点的比较,A2ARKO组钙结合蛋白免疫反应阳性细胞均显著多于A2ARWT组(P<0.01)。A2ARKO组和A2ARWT组,在缺血2h与再灌注22h时点比较无显著差异(P>0.05);与缺血2h及再灌注22h时点比较,再灌注46h时点钙结合蛋白免疫反应阳性细胞显著减少(P<0.01)3.光镜下见AQP4免疫反应阳性物质位于细胞膜下,主要表达于星形胶质细胞,也见于血管内皮细胞和室管膜细胞,梗死灶周边区阳性细胞较多。在梗死灶周边计数阳性细胞并做组间比较。在脑缺血后各时点,与假手术组比较,A2ARKO组和A2ARWT组AQP4免疫反应阳性细胞均显著增多(P<0.01)。脑缺血2h、脑缺血后再灌注22h和46h,A2ARKO组AQP4免疫反应阳性细胞均显著少于A2ARWT组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。A2ARKO组,与缺血2h时点比较,再灌注22h及再灌注46h时点AQP4免疫反应阳性细胞显著增多(P<0.01);与再灌注22h时点比较,再灌注46h时点AQP4免疫反应阳性细胞显著增多(P<0.05)。A2ARWT组,在脑缺血后各时点比较均有显著差异(P<0.01),随着缺血时间延长,AQP4免疫反应阳性细胞逐渐增多。4.脑缺血2h后再灌注46h,A2ARWT组和A2ARKO组脑梗死侧的组织含水量均显著大于非梗死侧(P<0.01)。与A2ARWT组比较,A2ARKO组脑梗死侧的组织含水量显著较少(P<0.05),非梗死侧无显著差异(P>0.05)5. A2ARKO组和A2ARWT组脑梗死体积与CB免疫反应阳性细胞数间均呈负相关(r=-0.764,p<0.01; r=-0.506,p<0.05);A2ARKO组和A2ARWT组脑梗死体积与AQP4免疫反应阳性细胞数间均呈正相关(r=0.837,p<0.01; r=0.809,p<0.01)。结论:1.阻断腺苷A2A受体对脑缺血急性期和再灌注期损伤均有保护作用;2.阻断腺苷A2A受体可减轻缺血引起的脑水肿;3.阻断腺苷A2A受体对脑缺血/再灌注损伤的保护作用可能与抑制细胞内钙超载和水通道蛋白AQP4的表达有关。