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细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lyphocyte,CTL或Tc)在T细胞免疫应答中发挥重要作用,CTLs通过其细胞表面的特异性TCR与抗原提呈细胞上的MHC—Ⅰ类分子-抗原表位复合体结合,在第二信号的共刺激作用的协助下,特异性CTLs被诱导活化和增殖,产生特异性杀伤效应;这是机体有效控制各种感染、抗肿瘤及抗移植物的重要途径之一。长久以来,刺激特异性CTLs活化和增殖以及检测特异性CTLs的频数一直是细胞免疫研究的热点,然而体外研究CTLs的活性和功能存在许多困难如:抗原特异性CTLs的体外培养比较困难,扩增过程带来大量非抗原表位特异性T细胞,很难保证T细胞的抗原特异性,此外缺乏精确分析抗原表位特异性T细胞的频数及快速分离扩增这类细胞的技术。特别是对体内反应的T细胞克隆的频数和性质分析起来更为困难。以往的分析方法,如51Cr释放法、细胞因子分泌细胞的记数法,需体外培养,周期长,特异性差;近年来可溶性MHC-肽四聚体法成为新兴的研究方法,可用于分析和分离各种抗原特异性CTLs的表型,也可以用来研究抗原特异性CTLs反应,为进行与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、特异、敏感的检测手段。目前美国已开发出多种特异性MHC-肽四聚体,已被用于研究病毒性感染及肿瘤等多种疾病及其疫苗的效果评价,如HIV、EBV、CMV、黑色素瘤、宫颈癌等的研究。然而,MHC-肽四聚体制作过程中存在着复性率低、步骤繁琐等不足,而且从国外进口,价格昂贵,为解决这些问题,我们首次构建了新型抗体HLA-肽多聚体,进行了特异性表位CTL的刺激活化和检测方法的研究,并且首次固定抗体多聚体,筛选特异性T细胞,为建立新的特异性CTL的活化方法及筛选技术平台奠定了基础。 首先,我们将HLA-A*0201重链和轻链重组蛋白进行表达、发酵和纯化,HC和β2m重组蛋白的分子量约为32KD和13KD,表达水平分别为菌体总蛋白的43%和47%,经专利技术处理包涵体后,纯度得以大大提高,用Superdex 75凝胶过滤纯化后,HC的纯度达到95%,可用作抗原进行多克隆抗体和单克隆抗体的制备。 第二,以纯化的HLA一A*0 201重链重组蛋白免疫产蛋种鸡,三次免疫后卵黄抗体的滴度达到1:10“,经水稀释法纯化后,其纯度达到88%,其蛋白质含量为9.77mg/ml卵黄,用细胞一ELIsA法鉴定,可与HLA一A*0201阳性的Caski细胞特异性结合。说明卵黄抗体可与天然结构的HLA一A*0201结合,可用于下一步的抗体多聚体的制备。 第三,用纯化的HLA一A*0 201重链重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次细胞融合,平均融合率为98%,阳性率为85%,选择6个克隆株连续3次克隆化阳性率达100%,得到三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞IAg、2H9和3C5,其中3C5属IgGI亚型,IAg和2H9属IgGZa亚型。以纯化的HC重组蛋白为抗原,三株单抗培养上清的ELISA效价为1:128一1:512,腹水效价为1:12800一1:25600。间接免疫荧光法显示,3株单抗均与HLA一A*0 201-的NS一1细胞没有反应,其中2H9株与HLA一A*0 201十的Caski细胞结合,而IA9和3C5无反应。说明2H9株的单克隆抗体可与天然结构的HLA一A*0 201结合,可用于下一步的抗体多聚体的制备。 第四,通过特异性肤段(流感病毒GILGFVFTL、巨细胞病毒NLVPMVATV)与HLA一A*0201重链和轻链重组蛋白的共同复性,得到HLA一AZ一肤组装复合体,两种HLA一AZ一肤组装复合体均可与W6/32单抗呈阳性反应,表明HLA一AZ一肤组装复合体与天然结构是一致的,HLA一AZ一肤组装复合体分别与HC卵黄抗体和单克隆抗体共孵育后,做非还原SDS一PAGE电泳,均显示有多聚体形成。说明成功构建了卵黄抗体和单克隆抗体HLA一肤多聚体。 第五,用CMV特异性单克隆抗体HLA一肤多聚体与外周血单核细胞(PBMC)反应,间接荧光标记后流式细胞仪检测CMV特异性CTLs的频数,结果表明单克隆抗体HLA一肤多聚体间接荧光法与C柳特异性MHC一肤四聚体检测无显著差异。说明新型抗体HLA一肤多聚体可用于特异性CTLs的检测。为进一步研究抗体HLA-肤多聚体对单表位特异性CTLs的作用,我们将CMV特异性卵黄抗体HLA一肤多聚体或单克隆抗体HLA一肤多聚体与PBMC共同培养后,发现两者刺激PBMC后CMV特异性CTLS均有增加。用卵黄抗体HLA-肤多聚体或单克隆抗体HLA一肤多聚体包板后与PBMC共孵育,吸附在板上的PBMC在抗CD3单抗的作用下继续培养,均发现PBMC中CMV特异性表位CTLs有显著增加。说明抗体HLA一肤多聚体不仅可结合特异性CTLs,而且能有效刺激抗原表位特异性CTLs的增殖,这将对特异性CTLS的活化机制和筛选方法研究具有重要的理论意义和应用价值。 综上所述,我们将HLA一A*0201重链和轻链重组蛋白表达、发酵和纯化,用纯化的重链重组蛋白作为抗原,制备卵黄抗体和单克隆抗体,同时制备CMV特异性表位的HLA一A*0201一肤组装复合体,与卵黄抗体和单克隆抗体合成了新型抗体HLA一肤多聚体,进行了CMv特异性表位的CTLs的检测,为研究各种感染和肿瘤的发生、发展和预后等过程中的细胞免疫机制,以及T细胞疫苗的评价打下坚实的基础。另外,我们用构建的抗体HLA一肤多