大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在西方国家恶性肿瘤的发病率中居第2位，在我国居第4位。术后5年生存率处于50%左右，约半数的患者术后出现复发和转移，尤以肝转移最为常见。大肠癌干细胞的分离成功及对其生物学性状的研究，为大肠癌的治疗提供了新的研究方向。Hedgehog（Hh）信号通路发现于1980年，Hh通路紊乱与肿瘤关系密切。Hh通路成员基因的异常表达会引起下游靶基因转录异常，伴发细胞分裂增殖异常，最终可导致肿瘤形成。环巴胺作为Hh信号通路抑制剂,在诱导癌变细胞凋亡的同时,对正常细胞的生长影响较小。2009年Warnat F等的研究发现，Hh通路异常可促进大肠癌细胞生长及转移，Hh通路功能与干细胞的存在及自我更新相关。干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞,有研究者发现恶性肿瘤进行性生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性相似,继而推测肿瘤是干细胞分化增殖失调而产生的异常组织,并提出了肿瘤发生的干细胞学说。该学说认为，肿瘤是发生在干细胞水平的疾病，肿瘤干细胞具有干细胞样的特性，具有自我更新、无限增殖及多向分化能力；其在肿瘤中虽只占少数，却是肿瘤发生、发展与转移的根源。肿瘤干细胞学说的建立，有助于加深对肿瘤的起源和本质的理解，为转变治疗模式，靶向杀伤肿瘤干细胞，临床上彻底治愈恶性肿瘤提供可能。2006年Catherine及Lucia分别在发表了大肠癌干细胞的研究成果。他们从大肠癌患者新鲜组织标本单细胞悬液中分离出CD133阳性的大肠癌细胞群体,发现其在NOD/SCID小鼠体内形成瘤能力远高于未分选及CD133阴性的细胞，证实其具有干细胞特性。基于大肠癌治疗现状，大肠癌细胞中存在Hh通路异常，大肠癌干细胞理论及实践的发展这三点现状，本文研究Hh通路阻断对大肠癌细胞及大肠癌干细胞影响。本文应用Hh通路阻断剂环巴胺对大肠癌Caco-2细胞进行了Hh通路靶向阻断。发现其对Caco-2细胞有明显的增殖抑制作用，并证实此作用主要是通过促进细胞而凋亡实现的。本文进一步应用蛋白质组学技术对Caco-2细胞线粒体蛋白质进行差异分析，共发现57种表达差异明显蛋白，其功能主要涉及细胞增殖与凋亡、细胞骨架、应激和免疫、核酸代谢及蛋白质合成、信号转导相关酶系等。其中与细胞增殖及凋亡相关蛋白5种,ATF6、Clusterin、OPA1、RGD1565411表达下调，Cofilin则表达上调，对其进一步研究，有可能加深对Hh通路调控的下游基因及Hh通路与其它信号系统间相互作用的理解。以上研究证实了Hh通路阻断对大肠癌具有增殖抑制作用及可能的机制。本文选择从大肠癌恶性腹水中分离原代大肠癌细胞，并进行扩增，应用NOD/SCID小鼠作为成瘤动物，足够量的原代大肠癌细胞接种后，可有效成瘤，并作为进一步扩增及分离干细胞的来源。培养扩增得到的大肠癌细胞经染色体核型分析，发现其具有复杂核型，符合大肠癌细胞系标准。我们应用CD133结合的免疫磁珠，通过MACS立法，分离并得到了CD133阳性大肠癌细胞，分选后经流式细胞仪鉴定，一次分选CD133阳性率达80%，二次分选CD133阳性率可达95%以上。体外实验利用其可耐受无血清培养特性，进行克隆形成试验，体内通过NOD/SCID小鼠进行成瘤实验，同时比较其分化前后CK20表达，以上三方面的实验均证实所分选的CD133阳性大肠癌细胞成瘤能力强于分选前大肠癌细胞，证实其具有干细胞特征。对本文建立的大肠癌细胞系进行了增殖抑制实验，发现Hh通路阻断剂环巴胺可有效抑制上述大肠癌细胞的生长。同时发现环巴胺可使上述大肠癌细胞系中CD133阳性细胞比例减低，初步确定了环巴胺对新培养的大肠癌细胞系及CD133阳性细胞具有增殖抑制作用。应用环巴胺对大肠癌干细胞进行干预研究，通过含血清的克隆形成抑制实验及Transwell肿瘤细胞迁移抑制实验，我们证实Hh通路阻断剂环巴胺可以抑制大肠癌干细胞的克隆形成能力及迁移能力，再通过体内实验，发现应用环巴胺作用于CD133阳性细胞后，接种后NOD/SCID小鼠成瘤能力减弱。以上研究结果证实了Hh通路阻断剂环巴胺可有效抑制大肠癌细胞系Caco-2的增殖，其主要机制可能是促进细胞凋亡。同时在环巴胺促进细胞凋亡过程中，线粒体的改变可能有重要的作用。蛋白质组学检测发现线粒体差异蛋白主要包括细胞增殖与凋亡、细胞骨架、应激和免疫、核酸代谢及蛋白质合成、信号转导相关酶系等方面，其中与凋亡密切相关的蛋白包括ATF6、Clusterin、OPA1、RGD1565411表达下调，Cofilin，为研究Hh通路效应基因提供了方向。以大肠癌患者恶性腹水为来源,成功扩增出新的大肠癌细胞系，染色体分析示其有较复杂的核型。以CD133为标记的免疫磁珠，应用磁性分选技术，经达二次过柱分选，可以分离到纯度较高的CD133阳性细胞。分离得到的CD133阳性细胞在体外形成克隆及体内成瘤实验中证实其成瘤能力明显高于其来源的大肠癌细胞群体，其分化前后上皮源性标记表达一致，从而证实其具有干细胞特性。通过Hh通路阻断剂作用于所得大肠癌细胞，发现环巴胺对其具有增殖抑制作用，但效应略弱于对Caco-2的增殖抑制作用。同时检测发现，Hh通路抑制剂环巴胺可减少细胞系群体中CD133阳性细胞比例。体外试验发现其可以抑制大肠癌干细胞的克隆形行及迁移能力，体内实验发现可以降低大肠癌干细胞的成瘤能力。通过上述研究证实，Hh通路阻断对大肠癌及大肠癌干细胞恶性生物学行有确切的抑制作用，对其机制的进一步研究，将有助于大肠癌靶向治疗的研究，提高大肠癌的临床疗效。