背景骨骼以往被认为是惰性器官,主要参与骨质钙磷代谢,但近年来研究提示骨骼同时具有生物活性,它可采用自分泌、旁分泌或分泌入血远距分泌的方式,使自身合成或分泌骨调节蛋白、生长因子、炎症因子等多种活性物质参与多器官组织的代谢与功能调节。因而,骨骼也具有内分泌功能,作为机体内活跃的内分泌器官参与机体的多种代谢调控。成骨细胞分泌的骨钙素(Osteocalcin,OC)与糖代谢、脂代谢、胰岛素抵抗及能量消耗等密切相关,而2型糖尿病患者多有糖脂代谢紊乱,易发生非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)及动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)。人们认识到骨钙素与NAFLD及AS之间有一定联系,但这方面研究相对较少,且既往研究多是针对糖耐量正常、空腹糖调节受损、2型糖尿病(Tyep 2 Diabetes Mellitus,T2DM)三种不同糖耐量状态人群中血清OC与糖脂代谢的相关性分析,且多未排除降糖/降脂药物对糖脂代谢的干扰、雌激素和骨质疏松症对骨钙素水平的干扰等干扰因素。若以初诊未进行降糖、降脂治疗,骨密度正常的男性T2DM患者为研究对象,可排除降糖/降脂药物对糖脂代谢的干扰、雌激素和骨质疏松症对骨钙素水平的干扰等因素对研究的干扰,进一步明确糖尿病早期OC与糖脂代谢的关系,探讨OC作用机制,以期为治疗糖尿病及其相关并发症提供更多理念、思路和方法。近年多个研究表明OC参与了能量消耗、糖脂代谢和胰岛素分泌的调节,对骨和能量代谢器官之间的复杂通路中起着重要的关联作用。作为代谢中枢器官的肝脏亦参与了多种物质代谢过程。那么OC与代谢异常造成的肝脏疾病如非酒精性脂肪性肝病有什么样的关系?目前OC与糖尿病合并NAFLD的相关性研究的报道结果并不一致且并不多见,有必要探讨T2DM合并NAFLD与OC的关系,以期为临床上糖尿病及NAFLD的预防和诊疗提供新的理论依据和方法途径。此外,有研究发现糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、NAFLD等均是AS的发生的危险因素,亦有研究提示OC与糖代谢、脂代谢、NAFLD均有密切联系,那么血清OC与动脉粥样硬化有什么样的联系?有必要评估初诊男性T2DM人群血清OC与CIMT的关系。颈动脉内膜增厚是动脉粥样硬化靶器官损害的标志,颈动脉内中膜厚度(Carotid intima-Media Thickness,CIMT)是T2DM大血管病变可靠的定量指标,是早期全身动脉粥样硬化的可靠指标。因而有必要分析骨钙素与CIMT之间关系,明确血清骨钙素与糖尿病大血管病变关系,为糖尿病大血管并发症及早的预测和评估、诊断及治疗提供依据。综上,未应用降糖和/或降脂药物且骨密度正常的初诊男性T2DM患者是值得研究的对象,通过分析该人群中OC与糖脂代谢、NAFLD以及AS之间的关联,为后续深入研究OC与糖脂代谢、NAFLD及AS的相互作用机制,进行转化医学干预等相关疾病研究奠定坚实基础。目的本研究以初诊男性T2DM患者为研究对象,分别探讨OC与糖脂代谢、CIMT及NAFLD的相关性,以期为未来采用OC或OC类似物干预糖尿病大血管并发症及糖尿病合并NAFLD提供理论依据。方法研究一:(1)收集初诊得到确认,未接受过降糖和/或降脂药物治疗,且骨密度正常的男性2型糖尿病患者共105例。根据HbA1c水平将患者样本分为1A组(HbA1c≤7%)、1B组(7%<HbA1c<9%)及1C组(HbA1c≥9%)共三组;另外以血清OC中位数为分界线,将所有入组者分为1D组及1E组共两组。(2)所有患者采集既往史、个人史;测身高(Height)、体重(Weight),计算体重指数(Body Mass Index,BMI);空腹过夜后采集静脉血;测定血清各项生化指标,测血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholestrol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C);肝功能:采用动力学速率法测ALT(Alanine aminotransferase)、AST(Aspartate aminotransferase)、GGT(γ-Glutamyl Transpeptadase);采用己糖激酶法检测患者空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)水平;采用电化学发光法测定空腹胰岛素(Fasting Insulin,FINS);采用高效液相色谱法测定糖基化血红蛋白(Hemoglobin A1,HbA1c);采用电化学发光法测定空腹血清OC水平。(3)本研究采用胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance index,HOMA-IR)评价胰岛素抵抗,胰岛β细胞功能指数(Homeostasis Model Assessment ofβcell,HOMA-β)评价胰岛β细胞功能,计算公式依次为:HOMA-IR=FBG×FINS/22.5;HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)(%)。(4)本研究采用电子表格处理软件Excel对数据进行录入,运用社会科学统计软件包SPSS(Statistical Package for the Social Sciences)v23.0进行统计分析。分析各组血清OC变化趋势及其与其它代谢指标的关系,明确血清OC与糖代谢及脂代谢的关系。研究二:(1)收集初诊得到确认,未接受过降糖/降脂药物治疗,且骨密度正常的90例初诊男性2型糖尿病患者。测量收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)和舒张压(Diastolic Blood Pressure,DBP);使用全自动生化仪检测血清白蛋白(Albumin,ALB);应用散射比浊法测定C反应蛋白(C Reactive Protein,CRP);循环酶法测定同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY);氧化酶检测法测血尿酸(Blood Uric Acid,BUA);采用Sysmex XE2100全自动血液分析仪器检测血常规。其余临床资料同研究一。(2)根据中国肝脏病协会制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010修订版),符合以下情况可诊断为NAFLD:1)无饮酒史或饮酒折含乙醇量不超过140克/周,针对男性。2)排除病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病。3)肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。鉴于肝活检组织学诊断通常难以获得,医疗实践所应用的NAFLD临床诊断依据为:(1)肝脏影像学表现符合弥漫性脂肪肝的诊断标准且无其它原因可供解释;(2)代谢综合征及其相关组分患者出现不明原因的血清转氨酶和/或谷氨酰转肽酶(GGT)持续增高半年以上。在体重减低和胰岛素抵抗情况得到改善后,异常酶谱和影像学检查结果改善或恢复正常,临床上可以明确给出NAFLD诊断结论。将所有患者分为2A组(非脂肪肝组,T2DM未合并NAFLD)和2B组(脂肪肝组,T2DM合并NAFLD)共两个组;再以肝纤维化评分(NAFLD Fibrosis Score,NAFLDFS)取值0.676为分界线将2B组细分为2C组(肝纤维化低危组,NAFLDFS<0.676)和2D组(肝纤维化组,NAFLDFS≥0.676)共二个亚组。(3)采用SPSS v23.0进行统计分析,分析各组血清OC水平及相关代谢指标,进一步探讨血清OC与初诊男性糖尿病患者合并非酒精性脂肪性肝病的关系。研究三:(1)收集初诊得到确认,未接受过降糖/降脂药物治疗,且骨密度正常的61例初诊男性2型糖尿病患者(排除高血压病)。收集患者吸烟史。其余临床资料同研究二。(2)采用荷兰飞利浦公司EPIQ7C,周围血管探头频率设为7.5MHz。检查过程中选取双侧颈总动脉远段及颈内动脉近段距离分叉膨大部1.0-1.5cm处血管壁,分别测量动脉前、后壁内膜表面间垂直距离及管腔内膜界面得到颈动脉内中膜厚度(Carotid artery Intima-Media Thickness,CIMT)。CIMT<1.0mm为正常值;1.0mm≤CIMT<1.5mm为内中膜增厚;管壁不规则隆起增厚,CIMT≥1.5 mm,凸向管腔的局部结构变化则被视为粥样硬化斑块形成。根据CIMT将初诊男性糖尿病患者分为3A组(颈动脉内中膜正常组)、3B组(颈动脉内中膜异常组)两个组;3B组又细分为3C组(颈动脉内中膜增厚组)及3D组(颈动脉粥样硬化斑块组)两个亚组。(3)采用SPSS v23.0进行统计分析,探讨各组间血清OC差异及OC与CIMT的关系。结果研究一:(1)不同HbA1c水平组各项指标比较:1A组、1B组、1C组三组间HOMA-IR、HOMA-β的差异有统计学意义(P<0.05),从1A组到1B组再到1C组,HOMA-IR呈现渐次上升趋势,HOMA-β呈逐渐下降趋势。血清OC从1A组到1B组再到1C组呈递减趋势(P<0.05)。TG和FBG从1A组到1B组再到1C组有渐次升高趋势,1B组及1C组的TG、FBG值较1A组显著升高(P<0.05),从1B组到1C有升高趋势,但1B和1C两组组间比较无统计学差异(P>0.05)。FINS从1A组到1B组再到1C组有渐次升高趋势,1C组较1A组及1B组升高(P<0.05),1A组和1B组两组比较无显著差异(P>0.05)。(2)不同OC水平组各项指标比较:1D组与1E组两组间比较,年龄、TC、FINS、LDL-C、HDL-C等指标无显著性差异。与1E组相比,1D组BMI、HbA1c、FBG、HOMA-IR、TG等指标显著性升高(P<0.05),HOMA-β下降(P<0.05)。(3)血清OC与其它指标Pearson相关分析:Pearson相关分析结果显示,血清OC与与年龄、FINS、TC、HDL-C、LDL-C无相关性(P>0.05),与BMI、FBG、HOMA-IR、TG、HbA1c呈负相关(P<0.05),与HOMA-β呈正相关(P<0.05)。(4)血清OC与各指标的多元线性回归分析:为了评价哪些变量是血清OC的独立影响因素,以血清OC作为应变量进行多元线性回归分析,结果显示FBG(β=-1.512,P=0.042)、HbA1c(β=-0.032,P<0.001)及HOMA-IR(β=-1.077,P=0.042)是血清OC的独立负性影响因素。研究二:(1)非脂肪肝与脂肪肝组临床及生化指标的比较:2B组较2A组在年龄、BMI、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG、ALT、AST、CRP等指标方面显著升高(P<0.05),OC显著下降(P<0.05)。(2)三组临床资料及生化指标比较:2D组与2A组及2C组相比,FINS、CRP显著升高(P<0.05);2C组与2A组相比,HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG、ALT、CRP升高(P<0.05)。血清OC水平由2A到2C再到2D组呈逐步下降趋势,且三组间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。(3)OC与其它各指标的相关性分析:血清OC水平与各指标的线性相关分析提示,OC分别与年龄、BMI、脂肪肝(赋值:正常组=0;肝纤维化低危组=1;肝纤维化组=2)、HbA1c、FBG、HOMA-IR、TG、ALT、AST、GGT、CRP呈负相关(P<0.05),与HOMA-β呈正相关(P<0.05)。(4)NAFLDFS与临床及生化指标相关性分析:脂肪肝组所有患者的NAFLDFS与各指标的Pearson相关性分析显示,除年龄、BMI、AST与ALT等组成公式的变量之外,NAFLDFS分别与HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG、CRP等变量呈正相关(P<0.05),分别与OC、GGT等变量呈负相关(P<0.05)。Logistic多元回归分析,我们定义肝纤维化低危组和肝纤维化组(赋值:肝纤维化组=1;肝纤维低危组=0),定义为分组变量,并作为因变量,以HbA1c、FINS、HOMA-IR、TG、GGT、CRP、OC为自变量,结果显示HOMA-IR是T2DM合并NAFLD肝纤维化的独立危险因素,OR(Odds Ratio)值为1.134,95%CI为(1.046,1.229);OC为T2DM合并NAFLD肝纤维化的保护性因素,OR值为0.451(95%CI为0.207,0.985)。(5)T2DM合并NAFLD影响因素的Logistic回归分析:以脂肪肝为应变量,以骨钙素为自变量(将骨钙素按照四分位等分法分为四组,第一组骨钙素水平最低,第四组骨钙素水平最高),以年龄、TC、TG、LDL-C、AST、ALT、GGT、HbA1c及BUA等指标为协变量,采用多因素二分类Logistic回归模型进行分析,自变量和协变量采用Enter法进入方程。依次调整年龄、TC、TG、LDL-C、AST、ALT、GGT、HbA1c及BUA等指标,结果发现骨钙素仍然是脂肪肝独立的影响因素,第一组是第四组发生脂肪肝风险的8.049倍,说明骨钙素越低发生脂肪肝的风险越高,且这种关系独立于年龄、血脂、肝功能、血尿酸、血糖等因素。研究三:(1)比较CIMT正常组与CIMT异常组的临床及生化指标:与3A组相比,3B组年龄、HbA1c、SBP、TG、CRP等指标显著性升高(P<0.05),OC显著性下降(P<0.05)。(2)3A组、3C组及3D组三组临床资料及生化指标比较:三组间OC、HbA1c、SBP、TG、CRP的差异有统计学意义(P<0.05);HbA1c及TG从3A组到3C组再到3D组呈递增趋势(P<0.05);相比3A组,3C组及3D组SBP、TG显著下降(P<0.05);3C组与3D组两组间SBP、TG无显著性差异(P>0.05)。血清OC水平从3A组到3C组再到3D组呈递减趋势,且三组之间两两比较均有显著性差异(P<0.05)。(3)各组吸烟率比较:3A组吸烟人数所占百分比为29.41%,3C吸烟人数所占百分比为43.48%,3D组吸烟人数所占百分比为66.67%,三组间吸烟比例有上升趋势,但三组间比较所得差异无统计学意义(χ~2=5.473,P=0.065)。3A组吸烟人数所占百分比为29.41%,3B吸烟人数所占百分比为54.54%,二组吸烟比例呈上升趋势,但两组间比较差异无统计学意义(χ~2=3.106,P=0.078)。(4)各组脂肪肝发生率比较:3A组脂肪肝人数所占百分比为35.29%,3C脂肪肝所占百分比为69.57%,3D组脂肪肝人数所占百分比为76.19%,三组间比较差异有统计学意义(χ~2=7.520,P=0.023)。3A组脂肪肝人数所占百分比为35.29%,3B组脂肪肝人数所占百分比为72.73%,两组比较差异有统计学意义(χ~2=7.315,P=0.007)。(5)血清OC和各临床及生化指标的相关性分析:血清OC与各指标的相关性分析显示,血清OC与HbA1c、FBG、HOMA-IR、TG、CRP呈负相关(P<0.05);与HOMA-β呈正相关(P<0.05)。(6)CIMT与各指标的相关性分析:颈动脉内中膜厚度(赋值:正常=0;增厚=1;斑块=2)与各指标的相关性分析提示,CIMT分别与年龄、SBP、HbA1c、HOMA-IR、TG、CRP、BUA呈正相关(P<0.05),与血清OC呈负相关(P<0.05)。以CIMT为应变量,以年龄、HbA1c、SBP、TG、CRP、OC、T2DM是否合并NAFLD(未合并脂肪肝=0,合并脂肪肝=1)为自变量进行Logistic回归分析,结果显示HbA1c是CIMT的独立危险因素(β=0.860,P=0.017),OR值为1.446,95%CI为(1.102,4.654);T2DM合并NAFLD是CIMT的独立危险因素(β=0.387,P=0.041),OR值为1.180,95%CI为(1.026,5.357);血清OC是CIMT的独立保护性影响因素(β=-1.005,P=0.034),OR值为-0.823,95%CI为(0.322,0.967)。结论以初诊男性T2DM人群为研究对象,得出以下结论:1)随糖代谢紊乱加重,脂代谢紊乱加重;胰岛素抵抗加重;胰岛β细胞功能下降;血清OC水平下降。血清OC水平升高,T2DM患者体重指数下降;糖代谢紊乱、脂代谢紊乱减轻;胰岛素抵抗改善;胰岛β细胞功能更佳;提示骨钙素与胰岛素抵抗密切相关,骨钙素可能参与了糖脂代谢的调节。2)合并NAFLD的T2DM患者较单纯T2DM患者发病年龄更早,体重指数更高,且胰岛素抵抗更明显,糖、脂代谢紊乱程度更严重。骨钙素可能是T2DM合并NAFLD及T2DM合并NAFLD纤维化的保护性因素,胰岛素抵抗可能是T2DM合并NAFLD纤维化的危险因素。3)T2DM并发CIMT异常者较单纯T2DM患者糖代谢、脂代谢紊乱及慢性炎症程度更为严重,且合并NAFLD者更多。HbA1c及T2DM合并NAFLD是CIMT异常的独立危险因素,骨钙素是CIMT异常发生的独立保护因素。骨钙素可能通过改善糖脂代谢、胰岛素抵抗及NAFLD从而改善动脉粥样硬化。