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铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindley),兰科石斛属多年生草本植物,是《中国药典》收载的正品石斛之一。黄酮类化合物为铁皮石斛的次生代谢物质,是重要的药效成分,具有抗氧化、抗衰老、抗病毒等功效,同时也是植物自身抗病、抗逆的主要成分。目前对铁皮石斛黄酮类化合物的研究主要集中在成分鉴定和种类分析上,对其生物合成途径的研究还相对较少。本文以为石斛黄酮类化合物代谢途径的研究提供依据为目的,主要从三个方面进行研究,主要研究结果如下:1.铁皮石斛转录组测序对人工栽培的普通和紫色植株叶进行转录组测序分析。应用Illumina Hiseq 2000测序平台共得到独立基因64,195个,总长度,平均长度,N50以及GC含量分别为66,479,063 bp,1,035 bp,1,742 bp和42.47%;被注释到KEGG功能数据库的独立基因占35.92%。以普通叶为对照进行差异表达分析,得到差异表达基因7177个,其中表达为上调的有3155个,下调4022个,与黄酮类化合物合成相关的差异基因有13个,选取差异表达明显且表现为上调的查尔酮合成酶(CHS)、黄烷酮-3-加氧酶(F3H)和二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因进行克隆和表达研究。2.铁皮石斛查尔酮合成酶基因的克隆及原核表达以转录组测序结果为参照,选取差异表达明显的查尔酮合成酶基因进行研究。通过同源克隆和RACE技术相结合的方法,克隆得到了查尔酮合成酶基因的cDNA全长,命名为DcCHS(GenBank登录号为KR078267)基因。DcCHS基因全长1311bp,开放阅读框1188bp,编码395个氨基酸,预测相对分子质量为43.14Kda。BLAST和氨基酸序列多重比对结果显示Dc CHS基因编码的氨基酸与其他物种的同源度较高;系统进化同源性分析,显示Dc CHS基因与兰科植物(如白苇兰属)聚为一支,属于Orchid CHS group 1的成员,处于较高的进化地位;成功构建原核表达载体pET32a-DcCHS,利用IPTG诱导pET32aDcCHS在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达并进行SDS-PAGE分析,结果显示产生了一个大小为43KD左右的蛋白,与预期结果相符合。利用高效液相色谱法对表达的蛋白产物进行酶活鉴定,结果显示pET32a-Dc CHS原核表达产物具有查尔酮合成酶的活性。3.DcCHS、Dc F3H、DcDFR基因的定量表达分析克隆Dc F3H和DcDFR基因的保守序列,并对Dc CHS、DcF3H、DcDFR基因进行荧光定量PCR分析。以普通植株叶为对照,发现三个基因在紫色植株中的表达量高于普通植株,并且在叶中的表达量高于茎,而在原球茎和组培苗中的表达量较少,这与转录组测序结果相一致。