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托品烷类生物碱(tropane alkaloids, TAs)是来源于茄科植物的一类次生代谢产物。莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)是TAs中最为重要的两种生物碱,在临床上是应用广泛的抗胆碱类药物。颠茄是TAs最主要的商业栽培药源植物,但莨菪碱和东莨菪碱含量均较低。因此,培育TAs高产药源植物成为相关产业长期追求的目标。近年来,代谢工程的兴起使得遗传改造TAs生物合成途径成为可能,而代谢工程依赖于对该途径的分子生物学和生物化学研究。本研究基于已有EST测序结果,采用RACE方法从颠茄中克隆到了一个类托品酮还原酶基因(tropinone reductase like, TRL) cDNA全长,命名为AbTRL1,并进行了生物信息学分析。在之前的实验中,本实验室还克隆到另一个TRL基因时cDNA全长,命名为AbTRL2,生物信息学分析发现其可能是颠茄托品酮还原酶Ⅱ,但并未对其进行进一步的功能验证。本研究构建了这两个基因的数字表达谱和诱导谱,在大肠杆菌中进行原核表达并纯化获得了重组蛋白质结合前体饲喂验证其功能,对AbTRL1相关氨基酸位点进行定点突变并验证突变后重组蛋白的酶活。最终结果表明：AbTRL2对托品酮和假托品均有催化活性;AbTRL1对托品酮和托品均没有催化活性,但定点突变Y110H后对托品酮有一定的催化活性。托品酮还原酶(tropinone reductase, TRs)是TAs合成途径中分支处的控制点酶,分为托品酮还原酶Ⅰ (tropinone reductase, TR Ⅰ)、托品酮还原酶Ⅱ(tropinone reductase, TR Ⅱ)两种类型。TR Ⅰ能够将托品酮(tropinone) 3位的羰基还原为α-羟基,形成托品(tropine); TRⅡ可以将托品酮3位的羰基还原为p-羟基,形成假托品(pseudotopine)。本研究以颠茄为材料,采用RACE技术,获得了AbTR1基因,其cDNA全长为1078 bp,包含一段长度为816 bp的编码区、14 bp的5’UTR和248 bp的3’UTR,polyA长度为15bp,终止密码子为TAA。其编码区编码一段含271个氨基酸残基的多肽,其预测分子量大小约为29.7 kD,等电点(pI)为6.75。对推断的AbTRL1基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示,AbTRL1与已报道的茄科其它物种的托品酮还原酶氨基酸序列相似性均在80%以上；从发育进化树上发现,AbTRL1在遗传距离上介于TRⅠs和TRⅡ。s之间,且与TRⅠs更近一些；保守结构域预测发现,AbTRL1的氨基酸序列中存在典型的短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR_c)特征性结构域,这与已经被鉴定的曼陀罗和莨菪的TRs属于SDR家族这一事实相吻合：三级结构预测发现,在AbTRL1的N端SDR所需要的NADPH结合区域,存在SDR优先结合NADPH的保守氨基酸残基Lys29和Arg51,但是在C端,底物托品酮结合区域中的3个对底物与酶结合起着关键作用的氨基酸,只有Alal58是一致的, 其余两个均不一致。数字表达谱和诱导表达谱分析表明,AbTRL1和AbTRL2在各个器官均有表达,属于组成型表达基因。AbTRL1在各个器官中表达差异不大,只在叶中表达量较低；AbTRL2除在成熟果中表达量较低外,在其他器官中表达量差异不大。AbTRL1和AbTRL2表达水平均受到ABA调控。在大肠杆菌中进行原核表达,对AbTRL1和AbTRL2重组蛋白进行纯化后,以托品酮、4-甲基环己酮(4-methylcyclohexanone)、3-奎宁酮盐酸盐(3-quinuclidinone hydrochloride)和托品、假托品为反应底物分别检测AbTRL1和AbTRL2重组蛋白的还原反应和氧化反应活性并测定Km、Vmax等酶活参数。蛋白酶活测定结果显示：AbTRL1蛋白对4-甲基环己酮有一定的催化活性,而对托品酮和3-奎宁酮盐酸盐不具有催化活性；而AbTRL2对托品酮、4-甲基环己酮和假托品均有催化活性,只对3-奎宁酮盐酸盐都没有催化作用。对AbTRL1的活性位点进行定点突变(Y110H),构建原核表达载体pET28-AbTRL1-Y110H并在Rosetta中进行原核表达。对AbTRL1-Y100H重组蛋白进行纯化后,以托品酮为反应底物,检测AbTRL1-Y110H的酶活并测定Km、Vmax等酶活参数,结果发现,AbTRL1-Y110H对托品酮具有催化活性。本研究通过对AbTRL1和AbTRL2功能的验证,表明AbTRL2为颠茄托品酮还原酶Ⅱ；同时首次在颠茄中克隆到了除TRⅠ和TRⅡ外的一个类托品酮还原酶基因AbTRL1,这是第一次在颠茄TRs中发现了新成员,通过对其生物信息学的分析,发现这三个TRs可能在进化上存在密切关系。AbTRL1本身不具有催化托品酮的活性,但是其突变体(Y110H)对托品酮产生了催化活性,这也说明了His110是托品酮还原酶的一个重要位点。这一研究对进一步了解TRs提供了实验基础。