背景与目的光动力疗法(PDT)多年以来一直应用于肿瘤治疗,是一种很有前景的癌症治疗手段。PDT过程的三个主要成分包括光敏剂(PS),特殊激发光和活性氧(ROS)。当用特殊激发光照射光敏剂时,光敏剂可通过产生的活性氧而杀死肿瘤细胞。然而,由于大部分激发光不能穿透深层组织,因此PDT的应用非常有限。但X射线有着很强的穿透力,所以被大量运用到PDT中。本研究中,我们使用的铜胺复合物(Cu-Cy)纳米颗粒,可以被低剂量的X射线激活。基于Cu-Cy和X射线的PDT过程可以产生ROS,并有效地杀死小鼠B16黑色素瘤肿瘤细胞并通过STAT3信号途径促进B16细胞的凋亡。此外,当用Cu-Cy和X射线联合作用于B16荷瘤小鼠时,肿瘤的生长受到明显的抑制。更值得注意的是Cu-Cy和X射线的联合治疗影响了脾脏和肿瘤中淋巴细胞的比例。树突状细胞(DC),CD4~+T和CD8~+T细胞,自然杀伤细胞(NK)的比例升高,M2型巨噬细胞的比例却明显下降。同时,体内和体外实验结果都表明Cu-Cy纳米颗粒本身对细胞和机体没有明显的毒副作用。总之,我们的研究说明Cu-Cy介导的PDT可以产生杀伤肿瘤的作用,同时诱发抗肿瘤免疫的形成。方法体外实验先用荧光共聚焦显微镜观察了Cu-Cy进入B16细胞的时间以及在胞内的分布。用CCK8细胞毒性检测实验测定了Cu-Cy对B16细胞的毒副作用,并且也测定了Cu-Cy经过2.5Gy的X射线照射后对B16细胞的毒副作用,从形态学角度分析并记录了B16细胞经过不同的处理后形态的变化。同时,通过流式细胞术和荧光共聚焦显微镜分析并观察了PDT作用于B16细胞后胞内ROS的产生。并用流式细胞仪检测了B16细胞受到不同处理后的凋亡情况。用western检测并验证凋亡相关的信号通路。另外,我们通过RT-PCR分析了B16细胞接受PDT后TGF-β1等细胞因子的变化。接着我们进行了相关的体内研究,首先通过皮下注射小鼠B16黑色素瘤细胞建立了黑色素瘤肿瘤模型。肿瘤体积达到300 mm~3时通过瘤内注射PBS和Cu-Cy,并分为X射线照射组和非照射组,6 h后使荷瘤鼠接受5 Gy的X射线局部照射,隔天治疗,总共治疗三次,实验过程中连续记录小鼠的肿瘤和体重的变化。所有治疗结束后取小鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾,采用流式细胞术检测和分析小鼠脾脏和肿瘤中免疫细胞的比例,同时,我们用苏木精-伊红染色(HE)实验检测Cu-Cy对机体主要器官毒副作用的大小,另外也用HE染色分析了Cu-Cy联合X射线治疗肿瘤后肿瘤组织的变化。结果体外实验表明,Cu-Cy与B16细胞共培养2,4,6 h后发现,培养6h后Cu-Cy进入细胞的量明显增加,且大量集中在细胞核中。CCK8细胞毒性实验表明Cu-Cy本身对B16细胞没有明显的细胞毒性,但经过X射线照射后,Cu-Cy可以明显的杀伤肿瘤细胞。同时,我们发现经过Cu-Cy和X射线联合处理B16细胞后,胞内ROS的量明显的升高。而且流式细胞分析表明X射线的照射进一步促进了B16细胞的凋亡。通过western实验我们发现,PDT作用后B16细胞中细胞色素C的表达量升高。同时p-STAT3(705)以及Bcl2的表达降低,Bax的表达量明显的升高,表明Cu-Cy联合X射线可以促进细胞凋亡。通过体内实验我们发现,瘤内注射Cu-Cy并接受X射线照射后,肿瘤的生长受到明显的抑制,但是小鼠的体重的脾脏没有受到PDT引起的病理性影响。我们分析小鼠脾脏和肿瘤中相关免疫细胞的比例后发现,与PBS,Cu-Cy以及PBS+X射线组相比,在Cu-Cy+X组中,脾脏中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例升高。同时,我们发现与PBS,Cu-Cy以及PBS+X射线组相比,在Cu-Cy+X组中,肿瘤组织里面除了CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例升高以外,DC细胞以及NK细胞的比例都升高,而且M2型巨噬细胞的比例有所下降。最后,HE染色结果表明,Cu-Cy联合X射线治疗对小鼠的心、肝、脾、肺、肾没有造成病理性副作用,但是它却明显的促进了肿瘤细胞的死亡。结论以上结果表明,本研究中使用的新型光敏剂Cu-Cy可以很容易的进入到细胞内。可以被低剂量的X射线激活并产生ROS,有明显的杀伤肿瘤细胞的作用,并可以进一步地促进细胞的凋亡并影响胞内相关细胞因子的表达。除此之外,体内的研究表明Cu-Cy经过X射线照射后可以明显的抑制B16黑色素瘤的生长,同时在体内诱导抗肿瘤免疫的发生。另外我们的体外和体内实验结果都表明Cu-Cy对细胞和小鼠机体没有明显的毒副作用。