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1.目的观察红花黄色素及红花有效成分羟基红花黄色素 A 抗心肌缺血的作用及其机理。2.方法(1)红花组分的制备及分析水提取法获得红花水提取液,以大孔树脂法柱层析法制备红花黄色素,大孔树脂-葡聚糖凝胶柱层析法制备羟基红花黄色素 A,HPLC 法对其纯度进行分析;(2)整体实验:取大鼠腹腔注射红花黄色素后腹腔注射异丙肾上腺素,连续三天,并于第三天麻醉动物,右侧颈动脉插管至左心室测定给红花黄色素前及其后给 ISO 前后心室内压的变化,测定后取心尖组织 HE 染色,光镜下观察心肌组织形态学变化。取大鼠同法实验,实验第三天左侧颈动脉插入导管测定给红花黄色素前及其后给ISO前后外周血压,并与实验结束后取血及心肌组织,铜皂形成法测定血浆游离脂肪酸,荧光素-荧光素酶法测定心肌组织 ATP,硫代巴比妥酸比色法测定心肌组织 MDA。(3)细胞实验:取三日龄 Wistar 大鼠乳鼠心室肌剪碎,胰蛋白酶消化得细胞悬液,洗涤后 DMEM培养液培养,两天后取此心肌细胞,将正常对照管培养液换为含糖台氏液,损伤管培养液换成无糖台式液,加入 HSYA 溶液,通入 N2后,37℃保温 60min,取上清液以 NAD动力学法测定 LDH 活性,弃上清液胰酶消化后细胞洗涤,蒸馏水破膜,取上清心肌细胞破膜液以荧光素酶化学发光法测定 ATP 含量。(4)其它离体实验:大鼠麻醉、开胸取心脏,清洗剪碎后制备心肌匀浆液,低温离制备线粒体,线粒体实验分为损伤对照管、损伤+HSYA 低、中、次高及高剂量管,各管分别于 37 ℃保温前后各测定 OD520,以⊿OD520%反映线粒体肿胀程度的变化。线粒体膜流动性实验中,线粒体制备缓冲溶液中加入大鼠心肌线粒体、 DPH 及不同浓度 HSYA。37 ℃保温 30 min 后,以 Ex 360 nm、Em 430 nm 测各管荧光偏振值计算得线粒体膜微粘度η。HSYA 缓解羟自由基诱发的线粒体脂质过氧化实验分为 H2O2/Fe2+损伤对照管、H2O2/Fe2++HSYA 低、中、次高、高剂量管,羟自由基损伤对照组以同体积蒸馏水代替 HSYA;正常对照组分别以同体积蒸馏水代替 HSYA、FeSO4及 H2O2;各组反应后以硫代巴比妥酸比色法检测 MDA。红花黄色素及羟基红花黄色素 A 的β受体拮抗作用实验所用大鼠心肌细胞膜制备法如下:大鼠取心室肌经剪碎、匀浆、低温离心,经纱布过滤得心肌细胞膜悬液。加入不同浓度 HSYA 液进行大鼠心肌细胞膜β受体结合实验, 测定各管 cpm 值并计算加药管标记配体与受体特异性结合占总结合的百分比 B ,经 Prism3 软件计算获得药物对[125I]-s-(-)-Pindolol 的竞争性抑制曲线,计算出不同药物与 β 受体结合的解离常数 Ki 及 IC50。以邻二氮菲-Fe2+氧化法检测 HSYA4 红花黄色素抗心肌缺血作用机理研究清除 H2O2/Fe2+体系产生的羟自由基,计算羟自由基清除率。制小鼠肝匀浆,加入受试药物,H2O2、FeSO4 后, 硫代巴比妥酸比色法检测 HSYA 的脂质过氧化抑制率。家兔耳正中动脉取血,制备生理盐水红细胞混悬液,加入不同浓度的受试药物,H2O2及 FeSO4 ,37℃振摇 60 min 后取出,离心后取上清测定 OD500 nm,计算受试药物的红细胞膜破裂抑制率。(5)基因差异显示实验:大鼠腹腔注射红花黄色素后给异丙肾,取心肌组织提取总 RNA,基因差异显示试验观察心肌基因表达水平在损伤组与给红花黄色素组之间的变化;加入 HSYA 的培养乳鼠心肌细胞缺氧缺糖损伤后提取总 RNA,基因差异显示试验观察心肌细胞基因表达水平在损伤组与给红花黄色素组之间的变化。3.结 果(1)红花组分的制备及分析HPLC 分析结果表明,此 SY 含 HSYA 83%,大孔树脂-凝胶层析法制备的 HSYA结果表明其 HSYA 纯度大于 98 %。(2)整体实验:SY 缓解异丙肾致心肌缺血大鼠心功能下降实验结果表明,ISO 致大鼠心肌缺血后,多种心功能数据均可见明显变化,心室内压最大变化率(+dp/dtmax 及-dp/dtmax)、心室峰压、发展压、心肌收缩成分缩短速度、心室峰压×心率等指标均下降,左心室舒张末期压明显升高或有升高趋势。两 SY 给药组左心室舒张末期压均较心肌缺血损伤组明显下降而与正常对照组接近,提示心功能得到保护。其它指标如+dp/dtmax、-dp/dtmax 均表现出 SY 缓解心肌缺血心功能下降的趋势,同时心肌缺血造成心室峰压×心率、心室内压及发展压的下降亦得到缓解,PPL 组的数据亦表明其具有缓解 ISO导致的大鼠心功能下降的趋势。心肌光镜切片观察结果表明,ISO 导致大鼠心肌缺血后,心室肌组织发生了明显的变性,而心肌缺血+SY 组上仍可见较明显组织变性及淋巴细胞浸润,提示 SY 大鼠腹腔注射未能明显缓解心肌缺血时的组织形态学变化。SY改善心肌缺血大鼠血压等变化的实验结果表明,ISO 致大鼠心肌缺血后,大鼠的最大收缩压、平均收缩压与平均动脉压均升高,心肌组织 MDA 及血浆 FFA 水平升高,心肌 ATP 水平下降,SY 及普奈洛尔均可缓解这种变化。(3)细胞实验:HSYA 缓解心肌细胞缺氧缺糖损伤实验结果表明,HSYA 可缓解缺氧缺糖损伤培养乳鼠心肌细胞 LDH 漏出和 ATP 含量的下降。(4)其他离体实验:SY 及 HSYA 缓解线粒体损伤的实验结果表明,线粒体肿胀实验中,损伤对照管37 ℃ 保温后,OD520 降低,线粒体肿胀加重。损伤+ HSYA不同剂量管 ⊿OD520%与损伤对照管比较均