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随着现代饲养业集约化程度的不断提高,氧化在商品猪生产中的危害已大量显现,可负面影响活体动物的免疫机能和宰后肉质特性等。抗氧化酶可缓解或者抑制自由基的负面效应,提高商品猪的抗氧化能力,进而改善商品猪的肉质。CuZnSOD(Copper Zinc Superoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成员之一,是集体防御氧化损伤的一种重要的金属酶,能转移性地清除超氧阴离子自由基,在维持氧自由基平衡方面起着重要的作用。为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记。本研究采用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)和Genome Walking的方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA和启动子区域进行克隆测序,分析基因结构和功能,并构建能在细胞中表达的真核表达载体。用QRT-PCR检测CuZnSOD基因的品种和组织差异表达,研究其表达对肉质性状和肉质抗氧化的影响。本研究主要分以下三个部分:1. CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号: GU944822),包含76 bp的5′UTR和120 bp的3′UTR序列。全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点PI为6.03。采用Genome Walking试剂盒扩增基因组的启动子序列,扩增得到1876bp的片段。CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点。二级结构中α螺旋仅占1.31%。在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和大鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%。基于蛋白序列所构建的分子进化树,表明猪与牛的亲缘关系最近。2.采用RT-PCR方法,以莱芜猪肌肉总RNA为模板扩增CuZnSOD基因的全长cDNA编码区序列,采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-CuZnSOD。随后将CuZnSOD进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。用脂质体将经过测序、验证的重组pcDNA3.1(+)/CuZnSOD质粒转染到山羊毛囊外根鞘细胞中,用QRT-PCR检测CuZnSOD基因mRNA的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/CuZnSOD真核表达质粒,转染山羊毛囊外根鞘细胞, QRT-PCR检测结果表明,所转染的CuZnSOD在山羊毛囊外根鞘细胞中成功表达。成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD,为进一步研究CuZnSOD在肉质抗氧化的作用中奠定了基础。3.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能检测到,同一个品种内CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的组织差异(P<0.05),其在肾脏、小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低。在肌肉、背膘和肝脏三种组织中CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的品种差异(P<0.05),并且CuZnSOD基因mRNA的表达始终是莱芜猪>鲁莱黑猪>大约克夏猪。CuZnSOD mRNA表达越高,SOD活性越高,MDA含量越低,肌肉的系水力越高、肉色越鲜艳,并且肉质越细嫩。