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急性髓性白血病(Acute myelogenous leukemia,AML)是我国最常见的恶性血液病。已有研究表明,白血病干细胞(Leukemia stem cell ,LSC)是产生白血病和维持白血病状态的祖先细胞。LSC多处在G0期,对常规化疗药物无效,是白血病复发的根源。近年的研究显示,IL3受体α链(CD123)是白血病干细胞(LSC)特异性的表面标志,而正常人类造血干细胞没有此标志。因而IL3受体α链成为治疗白血病的重要靶点。本课题拟用基因工程技术构建一种新的免疫毒素IL3-PE38KDEL,细胞因子白介素3(Interleukin-3,IL-3)为导向分子,铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL为细胞毒性分子,免疫毒素IL3-PE38KDEL可以靶向性的针对LSC发挥特异性的杀伤作用。目的:本实验通过构建pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL原核表达载体,表达并用金属Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,对目的蛋白进行功能复性,并采用MTT实验,用带有CD123表型的TF-1(人红白血病细胞)细胞株对融合蛋白IL3-PE38KDEL进行生物学活性鉴定,分析重组蛋白对TF-1细胞的杀伤效应及蛋白浓度影响关系,为将来的进一步研究奠定基础。方法:1.重组pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白的诱导表达及鉴定:构建的重组质粒IL3-PE38KDEL经限制性内切酶酶切鉴定,DNA双向测序证实克隆序列完全无误后转入表达菌SG13009中,经筛选用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Westernblot鉴定。2.用金属Ni2+亲和层析柱纯化分离出目的蛋白及重组蛋白IL3-PE38KDEL的生物学活性检测:提纯的目的蛋白经梯度透析复性,用MTT法观察不同浓度下重组蛋白IL3-PE38KDEL对含有CD123表型的TF-1人红白血病细胞侵袭过程的影响及对侵袭影响程度的剂量关系。结果:1.重组质粒载体在工程菌SG13009中得到高效表达,产物经SDS-PAGE方法鉴定为57kDa的带有组氨酸标签的融合蛋白,用抗6-His标签的单抗做Westernblot得到清晰单一的条带,证明融合蛋白成功表达。2.用金属Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度为90%以上的融合蛋白,梯度复性后得到纯度更高有活性的重组蛋白IL3-PE38KDEL,对TF-1人红白血病细胞侵袭的抑制呈剂量依赖性,发现当融合蛋白IL3-PE38KDEL的浓度为200μg/ml,作用72小时,对细胞侵袭能力的抑制达到高峰,约83%的细胞增殖能力受到抑制;而当浓度升至500μg/ml时抑制率无太大改变,为85%。结论:利用pQE30原核表达载体构建的重组质粒pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL能在工程菌SG13009中高效表达重组蛋白IL3-PE38KDEL,而且运用亲和层析技术能使目标蛋白得到有效的分离纯化。实验结果表明,重组蛋白IL3-PE38KDEL能有效抑制TF-1人红白血病细胞侵袭,说明利用原核表达系统可以得到有活性的融合蛋白IL3-PE38KDEL,而且这种抑制作用具有剂量依赖性。统计学证明对TF-1细胞侵袭的抑制作用具有统计学意义。发现经浓度为200μg/ml融合蛋白IL3-PE38KDEL作用72小时后,对细胞侵袭能力的抑制达到高峰,约有83%的TF-1细胞侵袭能力受到抑制;而当浓度继续升高直至500μg/ml时抑制率无太大变化,约85%的细胞侵袭能力受到抑制。这为将来探寻融合蛋白对AML干细胞NF-κB活性的影响及IL3–PE38KDEL对AML长期始动细胞(动物模型)的选择性作用打下实验基础。