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第一部分:MANF通过促进自噬,减少内质网应激对胰岛β细胞的损害目的:探讨高糖高脂对人体血清MANF的影响以及在GLU、PA和TG诱导的内质网应激(ERS)下,MANF是否能促进自噬,减轻ERS,保护胰岛β细胞。方法:从重庆医科大学附属第二医院内分泌门诊及体检中心收集60例健康对照(NC)、40例单纯高脂血症(HLD)及71例新诊2型糖尿病(T2DM)人群的血清标本。用人源性MANF ELISA试剂盒检测血清中MANF水平。利用课题组前期储备的胰岛组织切片,进行免疫组化实验,验证MANF在胰岛中的表达。同时用小鼠胰岛β细胞株MIN6进行体外实验,利用不同浓度的GLU,PA和TG处理MIN6细胞24 h后,用Western blotting技术检测MANF、ERS、自噬及凋亡蛋白的变化,用CCK8检测细胞增殖,以及Hoechst联合免疫荧光技术检测凋亡现象。用PA处理MIN6细胞24 h后,用透射电镜(TEM)检测细胞内自噬小体和亚细胞结构变化。PA和TG联合自噬抑制剂CQ干预细胞后,用Western blotting检测MANF,ERS和自噬通路蛋白的表达。为了进一步探讨MANF与自噬和ERS的联系,用人源性重组MANF蛋白联合PA处理细胞24 h后,Western blotting检测GRP78,mTOR及p-mTOR蛋白表达变化,并用TEM检测自噬小体及亚细胞结构的改变。结果:与NC组比,MANF在单纯HLD和T2DM组人群中表达依次增高,差异具有统计学意义(P﹤0.001)。在糖尿病亚组分析中,取非正态分布的空腹血糖中位数8.23为界,大于8.23的MANF水平显著高于空腹血糖小于等于8.23(P<0.05)。在小鼠胰腺组织切片中,验证了MANF在胰岛组织中有表达。体外实验,我们发现随着GLU、PA和TG浓度的增加,细胞增殖活性明显下降(P﹤0.01),MANF蛋白的表达呈浓度依赖性增加(P﹤0.05),且高糖联合高脂时,MANF的表达进一步增加,C-cas-3蛋白(P﹤0.05),ERS通路蛋白包括IRE1,GRP78,ATF6,ATF4,CHOP(P﹤0.05),自噬相关蛋白p62、LC3B、p-mTOR(P﹤0.05)的表达均呈浓度依赖性增加。免疫荧光双染发现随着GLU和PA浓度的增加,MANF和胰岛素的荧光强度呈浓度依赖性增强,并且GLU联合PA进一步增强。免疫荧光实验检测C-cas-3荧光强度也呈GLU和PA浓度依赖性增加。TEM检测,与BSA组比,PA组细胞线粒体数量增多且损伤,内质网明显扩张。CQ联合PA或TG后,MANF,ERS和自噬相关蛋白p62、LC3B及p-mTOR表达增加(P﹤0.05)。用重组人源性MANF蛋白联合PA处理细胞后,我们发现,与单独的PA组比较,PA+MANF组的MANF蛋白表达显著增加(P﹤0.001),而pmTOR(P﹤0.05)和GRP78蛋白水平表达减少(P﹤0.001)。与BSA组比,PA组自噬小体数目增加,线粒体损伤和内质网扩张,与PA组比,PA+MANF组自噬小体数目增加,未见线粒体损伤。结论:MANF蛋白在HLD和T2DM患者血清中表达增加。同时,GLU、PA和TG也能诱导MIN6细胞的MANF蛋白表达增加,抑制自噬,诱导ERS,抑制细胞增殖和促进其凋亡。这说明MANF参与调控自噬和ERS。MANF在这个过程中可能通过代偿性表达增加来保护β细胞。PA+MANF后,p-mTOR和GRP78蛋白水平表达减少,自噬小体数目增加。说明MANF能促进自噬,减轻PA诱导的ERS,从而保护胰岛β细胞。第二部分:利拉鲁肽通过调节MANF促进自噬,减少内质网应激,从而保护胰岛β细胞目的:为了探讨MANF与利拉鲁肽(LRG)的关系,以及LRG是否可以通过调节MANF来促进自噬,减轻ERS,从而保护胰岛β细胞。方法:用GLU、PA和TG联合LRG处理MIN6细胞24 h后,用Western blotting检测ERS、自噬相关蛋白及凋亡蛋白,用CCK8检测细胞增殖,用Hoechst联合免疫荧光技术检测凋亡现象。PA+LRG处理细胞24 h后,用TEM检测自噬小体和亚细胞结构变化。为了进一步探讨LRG、MANF与自噬的联系,用PA+CQ+LRG进行24 h干预后,Western blotting检测ERS及自噬通路蛋白的表达,CCK8检测细胞增殖。结果:GLU、PA或TG联合LRG组,与单独的GLU、PA或TG组比较,细胞增殖活性明显提高(P﹤0.05),同时MANF蛋白表达增加(P﹤0.05),C-cas-3蛋白表达减少(P﹤0.05),ERS相关蛋白IRE1,GRP78,XBP-1s,ATF4,CHOP表达下降(P﹤0.01),p62及p-m TOR表达下降(P﹤0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加(P﹤0.001)。C-cas-3荧光强度减少。与PA组比,PA+LRG组自噬小体数目增加。与PA+CQ组比,PA+CQ+LRG组,细胞活性提高(P﹤0.05),MANF表达增加(P﹤0.001),ERS相关蛋白表达减少(P﹤0.001),p62及p-m TOR蛋白表达减少(P﹤0.001),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加(P﹤0.001)。结论:利拉鲁肽通过调节MANF来促进自噬,减少ERS和细胞凋亡,并促进细胞增殖,从而保护胰岛β细胞。