轴向并行成像提高条带照明显微镜的成像通量

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脑内精细神经结构的解析至关重要,可提升神经生物学家对脑网络连接和功能活动的认识,进而帮助攻克人类脑疾病以及发展类脑人工智能。近年来,在获取生物脑结构信息的技术领域,光学显微成像技术因其具有亚神经元水平的分辨能力而引起广泛关注。为获取脑内神经连接网络,成像系统顺序遍历全脑的三维空间位置。然而,增大样本体积的或者提升成像分辨率时,顺序的遍历成像方式将导致成像时间剧增。目前,小鼠脑的全脑光学成像过程需要数小时甚至十余天,如果是人脑,理论上长达数年。因此,为实现以光学分辨水平解析完整人脑结构,提高全脑光学显微成像技术的成像通量是亟待解决的技术挑战。为此,本文提出了一种采用轴向并行成像方式提高条带照明显微镜成像通量的技术方案。本文探讨了相位调制在样本成像面产生轴向多光束并行照明的方法。阐述了相位调制控制样本成像面位置照明图案的原理,并对相位调制器件空间光调制器进行了性能测试及参数优化。在仿真分析了相位调制对单照明点源横向和轴向偏移的控制特性后,讨论了可并行产生多点照明并独立控制各点源三维空间位置的空间复用式相位调制方法。利用该方法对照明条带进行调制,设计并实现了轴向多层条带的并行照明。本文提出了采用梯度反射并行补偿多层照明光束远程聚焦后产生不同轴向偏移的方法,实现了在同一探测面上对不同层照明光源的并行探测。研究了偏离照明焦面后照明光束的远程聚焦规律,实验证明了远程镜面反射可补偿点光源偏离照明焦面造成的轴向探测偏移。在此基础上,研制了一种梯度反射镜,利用其多个反射平面成台阶状排列的特性实现了并行补偿多层照明的不同轴向偏移。将轴向多层并行照明和多层照明共面探测相结合,本文发展了一种利用并行获取轴向多层数据以提高条带照明显微镜成像通量的技术。利用所研制的梯度反射镜,在同一探测面上实现了对轴向多层条带照明的并行探测。提出了轴向多层条带照明并行成像的新方法,并讨论了不同成像模式下提高条带照明显微镜成像通量的设计差异。研制了轴向双层条带照明荧光显微成像系统,测试了系统性能并对eGFP荧光蛋白标记的小鼠脑片进行成像。实验结果证明了该方法可成倍提高条带照明显微镜的成像通量,有望为神经生物学家提供一种在全脑范围内研究脑网络连接的全新技术手段。
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