【摘 要】
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一种抗毒素能否有效地中和生物毒素,取决于它结合生物毒素中和表位的能力,因此,中和表位是免疫保护作用的核心靶点.线性中和表位由于其氨基酸序列在一级结构上是连续的,较容
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 解放军军事医学科学院
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一种抗毒素能否有效地中和生物毒素,取决于它结合生物毒素中和表位的能力,因此,中和表位是免疫保护作用的核心靶点.线性中和表位由于其氨基酸序列在一级结构上是连续的,较容易在体外模拟其天然表位.因此,该研究采用线性中和表位作为靶标,应用噬菌体抗体库技术,进行了人源抗毒素制备的研究,旨在获得特异、高亲和力的人源抗毒素,探讨以线性中和表位作为免疫、筛选抗原制备抗毒素的可行性,从而为其它中和抗毒素的制备提供理论和技术依据.该研究依据狂犬病毒糖蛋白Gp线性中和表位G5的氨基酸序列合成表位多肽G5-24,用狂犬病毒Vero疫苗和G5-24表位多肽对三名志愿者进行了免疫,从免疫者外周血淋巴细胞中分离、构建了单链抗体(scFv)基因,应用噬菌体抗体库技术构建抗狂犬病毒人源噬菌体单链抗体库;并用G5-24表位多肽筛选特异噬菌体抗体,分析确定针对靶标G5-24表位多肽的人源scFv基因.对筛选获得的人源抗G5-24 scFv(VL-VH)基因进行了重构,将它们克隆入表达载体pET22b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对重组表达蛋白用Ni-NTA柱纯化后,采用尿素梯度透析法进行复性.对scFv(VH-VL)和scFv(VL-VH)的亲和力和热稳定性进行了初步检测.为了提高抗G5-24 scFv的稳定性,应用PCR定点突变的方法分别在VH第44位和VL第100位引入Cys,构建抗G5-24 dsFv VH、VL基因,并将二者在原核表达系统PET-22b(+)/BL21(DE3)中分别表达.dsFv的生物学特性测定,以其亲本scFv作为对照,对其免疫学、稳定性和保护作用进行了评价.上述结果表明,该研究采用线性中和表位G5-24多肽作为免疫和筛选靶标,得到了特异性、高亲和力的人源噬菌体scFv,并成功地对抗G5-24 scFv进行了稳定性改构,制备了功能性人源抗G5-24 dsFv.表明以线性中和表位作为靶标,制备人源抗毒素的技术路线是可行的.
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