目的:　　 FGF对于腭形成极为重要，通过激活FGFR酪氨酸激酶调节着腭的发育。FGF和FGFR基因的突变都与腭裂相关。FGF信号在腭发育中的多种机制研究主要集中在上皮FGFR2，尽管FGFR1在腭间质表达且Fgf1突变与腭裂相关，但是对神经嵴细胞来源的间质FGFR1如何调节腭形成并不是非常清楚。本课题通过特异性敲除神经嵴细胞Fgfr1，以此来研究FGFR1在腭发育和腭裂形成中的重要作用机制。　　 方法:　　 1.Wnt1Cre转基因小鼠与Fgfr1flox小鼠交配，获得不同胚胎时期组织样品进行基因型检测。选择带有ROSA26报告基因的E10.5胚胎组织进行LacZ染色，比较野生型和Fgfr1敲除组早期额鼻突、上颌突和下颌突细胞生长变化。　　 2.选择E13.5，E14.5，E15.5各个时间点对照组和Fgfr1敲除组胚胎进行H&E染色，观察不同时期腭突形态的变化。同时对E12.5、E13.5和E14.5组织进行细胞增殖检测，分析不同时期腭突上皮细胞和间质细胞表现。应用TUNEL试剂盒来分析腭突细胞凋亡的改变。由于Wnt1Cre是在神经嵴细胞特异性表达，X-gal染色以此来判断腭突细胞来源。同时检测Vimentin在对照组和Fgfr1cKO组腭突细胞中的表达。　　 3.分离E13.5天胚胎腭突，在8μm孔径过滤膜上相互靠近进行体外培养，2天后收取组织，在组织解剖镜下拍照并进行石蜡包埋H&E染色，观察组织体外融合情况。利用免疫荧光的方法，检测腭突上皮细胞相关抗体的表达。P63是检测腭突上皮完整性的标志之一，E-cadherin是上皮细胞的标记物，Smad1/5/8是BMP信号通路下游分子。通过检测这几种抗体的表达可以显示腭突发育过程中结构完整性及可能的信号通路。提取腭突RNA进行Shh、BMP和Wnt信号通路相关分子检测。　　 结果:　　 1.我们通过Wnt1Cre的转基因鼠与Fgfr1flox小鼠杂交，特异性敲除神经嵴细胞Fgfr1导致了小鼠唇腭裂及其他严重头面部缺陷。在E10.5天时，对照组与敲除组外形相同，除了额鼻突和上颌突稍微减小。ROSA26报告基因追踪结果表明，与野生型相比，参与额鼻突、上颌突和下颌突形成的神经嵴细胞在敲除鼠中明显减少。在E14.5天和新生小鼠中发现，敲除鼠中线鼻突丢失，且表现出第一硬腭和第二硬腭裂还有唇裂。对照组和敲除组胚胎冠状面LacZ染色切片显示，ROSA报告基因分布区域及神经管形成没有差异。　　 2.通过E13.5、E14.5和E15.5胚胎的H&E染色观察显示，在E14.5天时对照组第二硬腭前段已经开始融合过程，内缘上皮细胞已经形成，同时腭突后段已经完成了上抬，且仍保持继续生长。Fgfr1cKO组腭突前后两段都仍然是向下方向生长，无法上抬及融合。免疫荧光检测E12.5、E13.5和E14.5胚胎腭突BrdU表达，结果显示E12.5和E13.5敲除组腭突前端上皮细胞和后端间质增殖细胞减少，前端间质和后端上皮细胞增殖没有区别。Fgfr1cKO组E14.5前端上皮和间质细胞还有后端上皮细胞增殖比对照组明显增加。TUNEL凋亡检测结果表明在E14.5胚胎对照组中嵴上皮细胞(MEE)凋亡比Fgfr1cKO组增加。　　 3.分离腭突体外培养2d，在对照组和Fgfr1cKO组中组织均可以融合。体外融合的腭突H&E染色显示内皮中线缝上皮细胞消失，但是两腭突间没有完全被间质细胞填充，仍有一定间隙。ROSA26报告基因追踪显示对照组腭突主要是由Wnt1 Cre表达的颅神经嵴细胞组成。原位杂交结果显示，与对照组相比Fgfr1cKO组间质细胞Fgfr1表达降低，上皮细胞Tgfβ3表达明显减少。Vimentin抗体检测对照组与Fgfr1 cKO组腭突均为阳性细胞。P63免疫组化结果提示敲除组前端上皮细胞不完整。对照组MEEs的E-cadherin染色模糊，Fgfr1 cKO组中也有相似的现象。荧光定量PCR结果显示，Fgfr1cKO胚胎在E10.5时Notch1和BMP4表达增加，Wnt1表达减少，而Wnt和BMP信号通路在E14.5的Fgfr1cKO组中都产生变化。此外，免疫荧光显示磷酸化Smad1/5/8阳性细胞在Fgfr1cKO腭突中明显增加。　　 结论　　 1.神经嵴细胞(NCC) Fgfr1特异性敲除引起腭突细胞增殖延迟，腭突上抬受损，从而导致了腭裂的产生。　　 2.颅神经嵴(CNC)细胞中FGFR1信号通过介导调节上皮和间质的信号传递调控腭的发育。