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H9N2禽流感(Avian Influenza,AI)属于A型流感病毒造成的低致病性禽流感,是禽类中流行广、危害大的一种重要传染病。H9N2禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)最早于1966年从北美火鸡体内分离到,我国1992年首次分离到该病毒后,在多个省份中相继爆发,H9N2禽流感病毒与多种病原体混合感染鸡群,造成养禽业严重的经济损失。我国1998年开始广泛使用商业化H9N2禽流感疫苗,有效的控制了疫情发展。但2010～2013年由于病毒的抗原漂移和基因重组,原有疫苗不能提供完全保护,在免疫鸡群中也能分离到H9N2禽流感病毒,导致H9N2禽流感病毒在我国仍广泛传播。本研究在2015～2016年期间从国内几个接种H9N2禽流感疫苗的鸡场,对H9禽流感疫苗抗体效价为16～128的鸡群定期采集病料,分离并鉴定到15株H9N2禽流感病毒;采用分子生物学技术以及动物实验对这15株H9N2禽流感病毒的基因变化和免疫原性进行了探讨。1.疫苗抗体压下H9N2 AIV的分离鉴定本研究从定期接种H9N2禽流感疫苗的鸡场中,采集含有疫苗抗体的病鸡或者健康鸡气管、肺脏、喉头以及泄殖腔棉拭子等病料,通过SPF鸡胚分离病毒,通过血凝和血凝抑制试验鉴定病毒。2015年分离到5株H9N2AIV,2016年分离到10株H9N2AIV。利用鸡胚终浓度稀释法进行了病毒纯化和毒力测定,分离株的鸡胚半数感染量(EID50)在10-6.20～10-8.25之间,分离株不能致死鸡胚,无法计算出鸡胚半数致死量(ELD50)。2.分离株的全基因组分析为探索含有疫苗抗体的鸡群中分离到的H9N2禽流感病毒的遗传分子特征,对15株分离株的HA基因和其中10株代表株全基因组进行测序分析。HA基因系统发育树分析表明,15株分离株均属以Ck/GX/55/05所代表的h9.4.2.5亚系。在HA系统进化树中,又可以将大部分2016年分离的毒株分为A分支,2015年分离株和部分2016年分离株分为B分支。H9N2禽流感疫苗株Ck/SS/94和Ck/SD6/96属于亚系h9.4.2.3,疫苗株Ck/SH/F/98位于亚系h9.4.2.1。结果显示,分离株HA蛋白裂解位点除分离株Ck/JS/TM151/16的蛋白裂解位点是HSRSSR↓GL外,其余14株都是PSRSSR↓GL;而疫苗株Ck/SH/F/98、Ck/GD/SS/94、Ck/BJ/1/94 的裂解位点是 PARSSR↓GL。分离株 Ck/FJ/SDLH35/15 和Ck/SD/WF39/16在第166～168位糖基化位点分别为NGT和NNT,糖基化位点数目为8个,其余分离株有7个糖基化位点;分离株Ck/JS/JT141/16增加145～147位NGT糖基化位点而缺失了 551～553位糖基化位点。分离株与疫苗株对比研究发现,由于分离株HA蛋白第220位产生T→I突变,缺失了 218～220位NRT糖基化位点,同时在HA蛋白的第313～315位增加了 NCS糖基化位点。早期的报道发现,在2008年前H9N2亚型禽流感病毒NA蛋白具有第264～266位糖基化位点,在第402～404位不具有糖基化位点,在2008年后NA蛋白在第264～266位点糖基化位点缺失,增加了第402-404位糖基化位点。而本研究的分离株NA蛋白的糖基化位点同时缺失了第264～266和402～404位点糖基化位点。分离株M2蛋白的第31位发生S31N突变,导致毒株获得金刚烷胺耐药性。PA基因没有T97I突变,但都发生A515T突变,有报道称PA基因的第515位氨基酸发生A515T突变后,病毒对鸭的致病力将会降低。疫苗抗体压下分离株PB2基因在第627位和第701位氨基酸均未发现突变。3.分离株的免疫原性研究根据分离株的HA基因进化树,挑选出9株位于不同遗传进化分支上的代表株,分别是 Ck/FJ/SDLH35/l 5、Ck/JS/TM 123/15、Ck/JS/WJ 179/15、Ck/AH/AHl 96/15、Ck/JS/JT 154/16、Ck/SD/WF39/16、Ck/JS/JT141/16、Ck/JS/TM210/16、Ck/JS/TM224/16。将这 9 株分离株的高免血清与H9N2亚型禽流感病毒的疫苗代表株Ck/SH/F/98病毒进行交叉血凝抑制试验。分析结果发现大部分分离株与Ck/SH/F/98株的抗原距离较大,表明这些在疫苗抗体压下的分离株的抗原性发生了变异,但是有2株分离株(Ck/JS/TM123/15和Ck/AH/AH196/15)的抗原性与Ck/SH/F/98株较近。根据抗原图谱中划分,可以将分离株分为4个区域,1组为分离株 SDLH35/15 和JT154/16,2 组为分离株 AH196/15 和 TM210/16,3 组为 WJ179/15、TM123/15、JT141/16 和 TM224/16,4 组包括疫苗株 Ck/SH/F/98 和 WF39/16。为检测含有疫苗抗体的鸡中分离的病毒的抗原特性,本论文在4个抗原区域中分别挑选1株病毒,进行分离株之间的交叉免疫攻毒保护研究。结果显示,3株代表株Ck/FJ/SDLH35/15、Ck/AH/AH196/15和Ck/SD/WF39/16的疫苗对自身病毒的保护率为100%,但是分离株Ck/JS/TM224/16对自身病毒的保护效率为83.3%,表明分离株Ck/JS/TM224/16的免疫原性有其特殊性。此外,Ck/FJ/SDLH35/15分离株疫苗对Ck/AH/AH196/15的保护率为83.3%,对 Ck/JS/TM224/16 和 Ck/SD/WF39/16 的保护率最低为 33.3%;Ck/AH/AH196/15 分离株疫苗对毒株Ck/JS/TM224/16和Ck/SD/WF39/16保护率较低,分别为16.6%和33.3%;Ck/JS/TM224/16 疫苗对 Ck/SD/WF39/16 保护率最低为 33.3%,对毒株 Ck/FJ/SDLH35/15 和Ck/AH/AH196/15 保护率为 100%,;Ck/SD/WF39/16 疫苗对 Ck/FJ/SDLH35/15 和Ck/AH/AH196/15的保护效率为100%,对毒株Ck/JS/TM224/16的保护率最低为33.3%。以上结果表明,含有疫苗抗体的鸡中分离的H9N2禽流感病毒基因和抗原性都发生了变异,其变异可能有作为RNA病毒的缺乏聚合酶校正功能以及疫苗抗体选择压的共同作用的作用,但是Ck/JS/TM224/16分离株对自身病毒的保护效率下降的现象警示我们要辩证认识禽流感疫苗的作用。