论文部分内容阅读
近年来,随着畜牧业的高速发展,兽药在保证食源性动物增产、增效的同时,食品中兽药残留已经成为一个日益严重的全球性公共卫生问题。兽药的不当使用会使其残留在动物可食用组织、鸡蛋和奶制品中,不仅影响国际贸易、造成经济损失,更重要的是会给消费者的健康带来潜在风险。为了满足监测和控制食品兽药残留的需要,急需建立简单、廉价、灵敏、快速和高通量的分析方法。本研究主要针对多肽类抗生素杆菌肽锌(BAC)和多粘菌素(POL)、截短侧耳素类抗生素泰妙菌素(TIA)和沃尼妙林(VAL)、抗寄生虫药硝碘酚腈(NIT)、氯氰碘柳胺(CLT)和碘醚柳胺(RAF)、非甾体类抗炎药双氯芬酸(DIC)和卡洛芬(CAR)、抗组胺药赛庚啶(CPH)和吩噻嗪类(PZs)兽药,设计并合成人工抗原,制备高灵敏度的单克隆抗体,以此为研究基础建立相应的免疫学快速检测方法。(1)根据BAC的结构特征,设计并合成了人工抗原BAC-BSA,获得了两株抗BAC单克隆抗体6D2-G10和3F2-F11细胞株,抗体亚型均为IgG1型。6D2-G10具有更高的灵敏度,IC50值为0.59ng/mL,亲和力常数为6.69×109L/mol,对BAC结构类似物几乎没有交叉反应。基于6D2-G10,建立了牛奶中BAC残留的胶体金试纸条快速检测法,裸眼消线值为25 ng/mL,利用试纸条读条仪扫描后,建立BAC标准抑制曲线,实现了牛奶中BAC的定量检测,IC50为3.16ng/mL,检测限为0.82ng/mL。批间和批内平均添加回收率为84.3%～96.0%,变异系数为4.9%～10.7%。(2)设计并合成了人工抗原POL-E-BSA,获得了一株可同时识别POL-E和POL-B的单克隆抗体4H11-C3,该抗体属于IgG1型,亲和力常数为3.20×109 L/mol。基于4H11-C3,建立了 ic-ELISA方法检测牛奶样品中POL-E和POL-B残留,牛奶稀释4倍即可降低大部分基质效应干扰,检测POL-E灵敏度IC50为0.21 ng/mL,线性检测范围为 0.03～1.44 ng/mL,检测限为 0.02 ng/mL。检测 POL-B 的 IC50为 0.40 ng/mL,线性检测范围为0.06～2.65 ng/mL,检测限为0.03 ng/mL。平均添加回收率为89.3%～103.4%,变异系数为3.9%～6.9%。(3)保留VAL和TIA的共同结构基团(三环刚性结构),成功合成了人工免疫原VAL-BSA,获得了高灵敏度的可同时检测VAL和TIA的单克隆抗体1B7-G10,该抗体为IgG1亚型,亲和力常数为1.28×109 L/mol,且对其他PLEs结构类似物RET、TYL、AVE、IVE和DOR无交叉反应。经ic-ELISA鉴定,检测VAL和TIA的IC50分别为0.99 ng/mL和0.39 ng/mL。基于1B7-G10,建立了胶体金试纸条方法定性定量检测猪肝中VAL和TIA,裸眼消线值分别为50 ng/g和25 ng/g,读条仪定量检测IC50分别为6.06 ng/g和3.45 ng/g,检测限为0.96 ng/g和0.29 ng/g,平均回收率为80.7%～102.0%,变异系数为4.6%～10.8%。(4)根据NIT、CLT和RAF的结构特征,设计合成了人工免疫原NIT-BSA和CLT-BSA,并获得了一株抗NIT单克隆抗体细胞株8G7-C6和一株可同时识别CLT、RAF的细胞株1E3-A10。两株单克隆抗体均为IgG1亚型,亲和力常数分别为2.93×109L/mol和8.90× 109 L/mol。8G7-C6的灵敏度IC50为0.96 ng/mL,且对NIT结构类似物无交叉反应。1E3-A10 抗 CLT 的 IC50 为 0.28 ng/mL,抗 RAF 的 IC50 为 0.39 ng/mL。基于 8G7-C6 抗体,成功建立了胶体金试纸条检测牛奶中NIT的残留,裸眼消线值为50ng/mL,IC50为5.71 ng/mL,检测限为1.14ng/mL。在牛奶中的平均添加回收率为84.6%～106.9%,变异系数为4.8%～9.9%。基于1E3-A10,我们建立了 ic-ELISA法检测牛奶中CLT和RAF,IC50为0.28 ng/mL和0.33 ng/mL,检测限为0.03 ng/mL和0.05 ng/mL,线性检测范围为0.05～1.63 ng/mL 和 0.08～1.38 ng/mL。(5)根据DIC和CAR的结构特征,设计并合成了免疫原DIC-BSA和CAR-BSA,成功获得一株抗DIC单克隆抗体1E5-B12和一株抗CAR单克隆抗体1F5-C8,两株单抗均为IgG1亚型,亲和常数分别为1.72×109 L/mol和6.19×109 L/mol。经ic-ELISA鉴定,1E5-B12 的 IC50 为 3.14ng/mL,1F5-C8 的 IC50 为 0.10ng/mL。基于 1E5-B12,建立了胶体金试纸条法检测牛奶中DIC,裸眼消线值为125 ng/mL,经读条仪定量检测后,IC50计算为8.54 ng/mL,检测限为1.40 ng/mL,牛奶添加DIC平均回收率为78.4%～104.3%,变异系数为4.7%～9.5%。基于1F5-C8,我们建立了胶体金试纸条检测牛肌肉中的CAR,裸眼消线值为12.5 ng/g,IC50为1.74 ng/g,检测限为0.28 ng/g,肌肉添加CAR平均回收率为79.5%～90.6%,变异系数为5.9%～8.8%。(6)采用溴乙酸亲核取代法修饰羟基化的CPH(COH),制备新型半抗原,应用活泼酯法将其与BSA偶联制备免疫原CPH-BSA,获得一株IgG1型广谱高灵敏度单克隆抗体10D3-C3,亲和力常数为7.35×109 L/mol。该抗体可同时识别CPH和6种PZs(APZ、FPZ、CPZ、PPZ、PTZ 和 TDZ)。经 ic-ELISA 鉴定,该抗体对 CPH 和 PZs 的 IC50 为0.03～0.76 ng/mL。基于10D3-C3,建立了胶体金试纸条检测方法,检测饲料中CPH和PZs的裸眼消线值为5～100ng/g,IC50为0.57～7.75 ng/g,检测限为0.10～1.35 ng/g。饲料添加CPH和PZs的平均回收率为79.0%～103.4%,变异系数为4.5%～12.7%。