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目的:本文旨在评价大黄素甲醚对慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)耐药细胞系K562/ADM多药耐药的逆转作用及其机制。方法:1.细胞培养:采用肿瘤细胞体外培养技术培养CML细胞系K562细胞与耐药细胞系K562/ADM细胞。2.CCK8(cell counting kit-8,CCK8):检测(1)K562细胞与K562/ADM细胞之间的耐药倍数;(2)不同浓度的大黄素甲醚药物干预后K562/ADM细胞的细胞活性;(3)微小RNA 146a(micro RNA 146a,miR-146a)抑制剂(miR-146a inhibitor)及靶向CXCR4 siRNA分别下调K562细胞中miR-146a及CXCR4的表达后,在阿霉素(adriamycin,ADM)的干预下K562细胞的活性;(4)大黄素甲醚联合ADM对K562/ADM细胞活性的影响。3.细胞克隆形成实验:检测大黄素甲醚联合ADM对K562/ADM细胞活性的影响。4.流式细胞术及Hoechst 33258检测细胞凋亡:检测(1)miR-146a inhibitor干预K562细胞后,检测K562细胞组、K562+NC组及K562+miR-146a inhibitor组中细胞的凋亡情况;(2)miR-146a mimic干预K562/ADM细胞后,检测K562/ADM细胞组、K562/ADM+NC细胞组及K562/ADM+miR-146a mimic细胞组中细胞的凋亡情况;(3)miR-146a及趋化因子受体-4(chemokine receptor-4,CXCR4)对K562细胞凋亡的影响;(4)大黄素甲醚联合ADM对K562/ADM细胞凋亡的影响;(5)降低K562/ADM细胞中miR-146a的表达后大黄素甲醚对阿霉素诱导的细胞凋亡的影响。5.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR):检测(1)K562细胞与K562/ADM细胞miR-146a的表达;(2)转染mi R-146a抑制剂下调K562细胞中的miR-146a的表达后各组K562细胞中miR-146a的表达情况;(3)K562/ADM细胞转染miR-146a mimic过表达miR-146a后,各组K562/ADM细胞中miR-146a的表达情况;(4)下调K562细胞中的miR-146a表达后,各组K562细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gP)、多药耐药蛋白-1(multidrug resistant related protein,MRP-1)、CXCR4的表达情况;(5)上调K562/ADM细胞中的miR-146a的表达后,各组K562/ADM细胞中P-gP、MRP-1、CXCR4的表达情况;(6)大黄素甲醚干预下K562/ADM细胞中mi R-146a的表达情况;(7)K562细胞中转染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制剂及转染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制剂后,各组细胞中CXCR4的表达情况;(8)不同浓度的大黄素甲醚对K562/ADM细胞中CXCR4表达的影响。6.蛋白免疫印迹:检测(1)下调K562细胞中的mi R-146a表达后,各组K562细胞中CXCR4的蛋白表达情况;(2)上调K562/ADM细胞中的miR-146a的表达后,各组K562/ADM细胞中CXCR4的蛋白表达情况;(3)不同浓度的大黄素甲醚干预K562/ADM细胞后,各组细胞中CXCR4的蛋白表达情况;(4)K562细胞中转染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制剂及转染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制剂后,各组细胞中CXCR4蛋白的表达情况。7.迁移实验:评估K562/ADM细胞中大黄素甲醚对CXCR12结合到CXCR4的影响。8.细胞表面的CXCR4:检测(1)下调K562细胞中的mi R-146a表达后,各组K562细胞表面CXCR4的表达情况;(2)上调K562/ADM细胞中的miR-146a的表达后,各组K562/ADM细胞表面CXCR4的表达情况。结果:1、miRNA-146a在K562/ADM细胞中的表达降低K562细胞和K562/ADM细胞经ADM干预48小时后的IC50分别为0.15μM和3.5μM,表明K562/ADM的耐药倍数是K562细胞的23倍;与K562细胞相比,K562/ADM中mi R-146a的表达明显较低。2、下调miR-146a能增强K562细胞对ADM的耐药性转染miR-146a抑制剂后mi R-146a的表达水平明显降低;下调miR-146a后的K562细胞的生存率明显高于正常的K562细胞及阴性对照组(IC50分别为2.8μM,0.15μM,和0.18μM。下调miR-146a能明显增强K562细胞抵抗ADM诱导的凋亡。3、上调miR-146a能使K562/ADM细胞对ADM的促凋亡更敏感转染mi R-146a mimic的K562/ADM细胞中的miR-146a表达明显增高,与K562/ADM细胞及转染空白质粒的K562/ADM细胞相比能明显增强K562/ADM细胞对ADM的敏感性(IC50分别为0.42μM,3.5μM及3.2μM),表明,上调mi RNA-146a能使K562/ADM细胞对ADM诱导凋亡的作用更敏感。4、miRNA-146a主要针对CXCR4参与K562细胞对ADM耐药性下调K562细胞中的mi R-146a或者上调K562/ADM中的mi R-146a未能引起P-gp及MRP-1的mRNA明显改变,而且miR-146a的表达与CXCR4 mRNA的表达呈负相关CXCR4是miR-146 a的直接目标。靶向CXCR4 siRNA能抑制细胞中CXCR4的表达;miR-146a抑制剂能诱导CXCR4表达的上调并且能明显地增强K562细胞的耐药性。5、大黄素甲醚能增强K562/ADM细胞对ADM的敏感性大黄素甲醚对K562/ADM细胞活性的影响呈剂量依赖性;耐药逆转倍数在2μM和5μM的浓度下分别为2.03倍和5.3倍。与单独用ADM干预的细胞相比,当大黄素甲醚和ADM联合作用于K562/ADM时,细胞集落数及集落大小明显减少。与单独用ADM干预相比,联合干预浓度在2μM和5μM大黄素甲醚作用于细胞后能显著增加K562/ADM细胞的凋亡。6、大黄素甲醚通过上调miR-146a和干预CXCL12/CXCR4信号通路逆转耐药大黄素甲醚干预细胞后能导致K562/ADM细胞中miR-146 a水平呈剂量依赖性增加。大黄素甲醚增强K562/ADM细胞对ADM敏感性的作用经miR-146a抑制剂干预后几乎完全消失。大黄素甲醚干预后导致K562/ADM细胞中趋化因子受体CXCR4的表达呈剂量依赖性降低,经大黄素甲醚干预后迁移明显受损。结论:1.下调miR-146和上调CXCR4可能与K562/ADM细胞的耐药性有关。2.大黄素甲醚可以通过诱导miR-146 a的表达抑制CXCL12/CXCR4信号从而逆转K562/ADM细胞对ADM的耐药性。