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目的:通过体外实验研究经验方“至精方”对大肠癌耐长春新碱细胞系(HCT-8/VCR)多药耐药的影响,探讨其可能的作用机制。
方法:①采用MTT(噻吩兰)法、Caspase-3分光光度法、流式细胞仪(FCM)等观察至精方含药血清对HCT-8/VCR的增值抑制和凋亡诱导作用。②以MTT法检测至精方含药血清对HCT-8/VCR细胞多药耐药的逆转作用,并以流式细胞仪(FCM)和实时荧光定量PCR(FQ-PCR)从P-糖蛋白(P-gp)途径来研究其逆转机制。
结果:⑴不同体积分数含药血清对HCT-8/VCR细胞存在一定的增殖抑制作用,随含药血清作用体积分数升高(0%~32%),HCT-8/VCR细胞存活率降低。经过与10%体积分数的含药血清共同孵育后,HCT-8、HCT-8/VCR两细胞系生长曲线均明显下降(P<0.05)。⑵10%至精方含药血清组HCT-8/VCR细胞300μg的蛋白样品在不同时间OD变化呈时间依赖性,在72h之后进入平台期(OD值=1.4)。在72h时间点,10%含药血清组和9μg/mL维拉帕米组的HCT-8/VCR细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.01),且两组之间差异无显著性(P>0.05)。⑶与含药血清作用72h后,10%至精方含药血清和9μg/mL维拉帕米可增加各个浓度的长春新碱对HCT-8/VCR细胞的抑制作用,与对照组相比均有明显差异(P均<0.05),而含药血清组和维拉帕米组相比无统计意义(P>0.05)。与含药血清作用72h后,VCR的IC50由原来的13.245±0.346,下降到0.973±0.093,其逆转倍数>13.6倍,与维拉帕米比较无统计意义(P>0.05)。⑷10%含药血清可明显下调HCT-8/VCR细胞P-gp表达水平,与单用长春新碱诱导组细胞相比差异有显著性(P<0.01),与维拉帕米组相比无统计意义(P>0.05)。经过72h孵育,与空白对照组相比,至精方含药血清使HCT-8/VCR细胞mdr1 mRNA表达明显下降(P<0.05)。
结论:①至精方含药血清对人大肠癌耐长春新碱细胞系(HCT-8/VCR)生长有明显抑制作用。②至精方含药血清能通过Caspase途径诱导HCT-8/VCR细胞凋亡。③至精方含药血清能使HCT-8/VCR细胞系mdr1 mRNA和P-gp表达下降。至精方可能通过下调mdr1 mRNA进而减少P-gp表达来实现其对多药耐药的逆转。