目的随着人口老龄化的持续发展,骨折的发病率呈上升的趋势。但由于老年患者机体功能下降,血管再生能力弱等因素,骨折不愈合和延迟愈合成为骨折术后常见的并发症。骨折愈合是一个复杂的过程,骨折后的血管损伤、血肿形成导致组织和细胞需要在低氧环境中进行一系列骨修复反应,而HIF-1α是低氧状态下最直接的调控因子,它有多种下游靶基因可以调控血管生成、能量代谢、细胞的增殖和分化,因此本研究的第一部分将探讨体内运用Co Cl2激活HIF-1α对骨折愈合的影响。另外,在低氧环境中有多种micro RNA进行精准的调控,它们对维持细胞在低氧环境中的活性有着非常重要的作用,本研究第二部分将关注在人内皮细胞处于低氧状态时会显著上调的mi R-429,探索其在低氧诱导后对MC3T3-E1细胞成骨分化的调控机制,为低氧促进骨折愈合提供一种新的机制。方法1.选取48只SD大鼠,制作胫骨干骨折模型后随机分为两组,实验组皮下注射Co Cl2(15mg/Kg),对照组注射等量的生理盐水,在骨折后第7、28、42天取材。然后通过X线、生物力学、组织形态学、q RT-PCR、Westen blot等方法检测Co Cl2干预后骨组织的结构、骨强度、低氧相关因子以及成骨标志物的变化情况。2.在培养基中加入200μM的Co Cl2诱导低氧,检测细胞的增殖和凋亡情况,通过q RT-PCR观察MC3T3-E1细胞中mi R-429的表达。随后在MC3T3-E1细胞中转染mi R-429过表达慢病毒,通过q RT-PCR验证转染效果,并利用ALP活性检测、茜素红染色、Westen blot等方法评价过表达mi R-429对成骨分化的做作用。3.运用基因预测软件筛选出mi R-429可能的下游靶点ZFPM2,利用q RT-PCR、Westen blot方法检测过表达mi R-429前后ZFPM2的m RNA和蛋白的变化情况,并利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证mi R-429对ZFPM2的靶向调控作用。4.对MC3T3-E1细胞转染ZFPM2基因的si RNA,通过Western blot实验检测抑制ZFPM2基因的效果;并利用ALP活性检测、茜素红染色、Westenblot等方法评价抑制ZFPM2对成骨分化的作用。5.建立小鼠胫骨干骨折模型,骨折局部注射过表达mi R-429的病毒试剂,通过X线、q RT-PCR、Westen blot等方法检测注射后骨组织的结构、mi R-429、ZFPM2以及成骨标志物的变化情况。结果1.Co Cl2干预组大鼠的X线评分、骨强度,骨组织中的HIF-1α、VEGF以及成骨标志物(ALP、Runx2和OC)的蛋白和m RNA表达均高于对照组。2.用Co Cl2培养MC3T3-E1细胞在诱导HIF-1α表达的同时上调了mi R-429的表达,但不会影响MC3T3-E1细胞的增殖和凋亡。成功对MC3T3-E1细胞转染mi R-429过表达病毒后,细胞中ALP的活性、细胞基质矿化水平以及成骨标志物(Runx2和OC)的水平均高于对照组。3.在过表达mi R-429组中ZFPM2的m RNA和蛋白明显低于对照组,双荧光素报告基因实验结果证实mi R-429能通过与ZFPM2 3’-UTR结合,从而抑制ZFPM2的表达。4.对MC3T3-E1细胞转染si RNA成功抑制ZFPM2基因后,细胞中ALP的活性、细胞基质矿化水平以及成骨标志物(Runx2和OC)的水平均高于对照组,但GATA4的蛋白水平低于对照组。5.在体内注射过表达mi R-429的慢病毒试剂后,骨折X线评分、骨组织中mi R-429、成骨标志物(Runx2和OC)的表达均高于对照组,ZFPM2的蛋白水平低于对照组。结论1.Co Cl2在大鼠胫骨干骨折模型中可以促进骨折愈合,Co Cl2诱导成骨以及促进血管生成可能是通过激活HIF-1α通路来实现的。2.在MC3T3-E1细胞中运用Co Cl2模拟低氧可以诱导mi R-429的表达,并通过靶向抑制ZFPM2的表达促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。