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目的:在前期研究的基础上,从调控MAPKs信号转导通路的角度探讨锦红片对小肠黏膜上皮细胞损伤模型细胞凋亡的调控作用,并为中医学“从肠论治”急性胆源性感染假说提供科学依据。 方法: 1.采用14日龄SD新生乳鼠,经酶消化法分离小肠黏膜上皮细胞,经差速贴壁法及相差消化法等方法去除成纤维细胞,细胞贴壁,并80%铺满培养皿后,用胰酶消化法消化传代,倒置显微镜下观察细胞生长状态,采用HE染色法、台盼蓝染色法、免疫荧光染色法对分离细胞进行组织学观察及鉴定,并经MTT法绘制细胞生长曲线。 2.采用LPS诱导小肠黏膜上皮细胞损伤模型,分为对照组和LPS组,通过MTT法检测细胞增殖率,TUNEL法检测细胞凋亡,real time-PCR检测小肠上皮黏膜细胞ERK1/2、JNK、p38 mRNA表达,Western-blot检测小肠上皮黏膜细胞ERK1/2、JNK、p38蛋白表达,并对ERK1/2、JNK、p38表达与细胞凋亡水平进行线性回归分析。 3.将小肠黏膜上皮细胞随机分为6组,分为对照组、LPS组、A干预组(空白血清,高、中、低剂量)、B干预组(锦红片药物血清,高、中、低剂量)、C干预组(庆大霉素,高、中、低剂量)及D干预组(P38抑制剂,高、中、低剂量),倒置显微镜下对小肠黏膜上皮细胞形态学观察,MTT法检测小肠黏膜上皮细胞增殖率、存活率及抑制率,并确定各干预组的最佳作用浓度及时间。之后,采用TUNEL法检测小肠黏膜上皮细胞凋亡,real time-PCR检测小肠黏膜上皮细胞p38 mRNA表达,Western-blot检测大鼠小肠黏膜上皮细胞p38蛋白表达。 结果: 1.该方法可以成功分离出小肠黏膜上皮细胞,并且24h后即可见到部分细胞贴壁,单层移行生长,贴壁细胞多为圆形,或扁平多角形,4-6d后可逐渐聚集、融合成片,呈现典型的“铺路石”样生长状态;而且,细胞经纯化及传代处理后杂质细胞明显减少。第2代细胞在生长过程中状态较好,增殖较快;细胞经免疫荧光染色及HE细胞爬片观察鉴定为上皮细胞;冻存及复苏处理后细胞状态良好。 2.小肠黏膜上皮细胞经LPS(10μg/mL)作用24h后,LPS组相对细胞数量以及增殖率均显著低于对照组(P<0.05),凋亡细胞数较对照组显著增加(P<0.05)。与对照组比较,LPS组ERK1/2、JNK、p38 mRNA及蛋白相对表达均有升高,其中,以ERK1/2蛋白相对表达最为明显(P<0.05)。而通过对细胞凋亡数和MAPKs信号转导通路的相关性比较后发现,P38的磷酸化表达在介导细胞凋亡的过程中贡献率最大。 3.通过对不同干预因素对LPS诱导急性胆源性感染大鼠小肠黏膜上皮细胞损伤模型细胞凋亡及P38表达水平的研究,各组细胞在干预后6h、12h、24h、48h、72h时间点的细胞总体生长状态差别较大,具有一定时间依赖性,LPS组细胞贴壁时间相对其余各组延长,细胞间聚集、融合缓慢;随时间延长大量细胞可见挛缩状态,胞膜不完整,增殖明显较正常组少;干预组贴壁尚可,但随时间延长,坏死细胞数量也在不断增加,细胞形态开始出现不同程度变化,胞膜完整性逐渐缺失,增殖速率仍明显受抑制。通过对各组不同时间点细胞增殖率、存活率及抑制率的综合比较,最终确定采用A干预组(中)、B干预组(高)、C干预组(中)及D干预组(高)作用24h作为重点观测细胞凋亡水平及P38表达水平检测对象。结果显示,与对照组相比,LPS组的凋亡细胞数呈明显增多,干预组凋亡细胞组呈明显减少(P<0.01)。与LPS组比较,除A干预组外(P>0.01),其余各组凋亡细胞数均显著减少(P<0.01);其中,B和D干预组较C干预组明显减少(P<0.01),D干预组凋亡细胞减少最为显著(P<0.01)。与对照组相比,各组P38mRNA相对表达均有所减少(P<0.05);与LPS组相比,除A干预组和C干预组外(P>0.05),B干预组和D干预组表达均增加(P<0.05);与B干预组相比,B干预组基因相对表达量高于A干预组和C干预组,其中,D干预组基因相对表达量较B干预组显著增加(P<0.05)。此外,各组P38蛋白相对表达均有所减少(P<0.05);与LPS组相比, A干预组、C干预组、B干预组和D干预组表达均增加(P<0.05);与B干预组相比, A干预组和C干预组均少于B干预组,其中,D干预组蛋白相对表达量较B干预组显著增加(P<0.05)。 结论:通过该法可建立较稳定的大鼠小肠黏膜上皮细胞体外原代培养细胞株,为小肠黏膜屏障功能障碍的生理病理及药物作用机制研究提供了体外研究平台。LPS作用早期即存在明显的小肠黏膜上皮细胞过度凋亡情况,MAPKs信号转导通路均参与了此过程;而锦红片能够在早期起到降低LPS对大鼠小肠黏膜上皮细胞毒性的作用,改善细胞增殖、存活及凋亡情况,并能够抑制肠黏膜细胞的过度凋亡,修复和保护肠黏膜的正常细胞结构,间接抑制LPS的损害作用,其效果明显优于庆大霉素,其机制可能与抑制P38/MAPK信号转导通路的过表达有关。