论文部分内容阅读
由于大豆分离蛋白(Soy Protein Isolate, SPI)具有高蛋白含量和功能特性被广泛应用于食品诸多领域，为进一步挖掘其高附加值，使其能更好的被广泛应用，对于SPI结构改造以及提高功能性质的研究一直是国内外研究的热点。本课题通过采用基因工程技术构建高效表达耐热丝氨酸蛋白酶高产菌株，确定最佳的诱导表达条件，通过分离纯化得到纯净的耐热丝氨酸蛋白酶并对SPI进行酶解改性，系统的研究了改性过程中的影响因素对SPI分散性指标的影响，并在乳制品行业中奶粉产品的加工应用进行了深入探讨，主要研究内容及结论如下：(1)以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的基因组DNA为模版，根据GenBank中报道的枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因序列(HM154526)设计引物，克隆出蛋白酶基因的目的片段，成功构建重组质粒pET-28a-Sapr，将其转化为高产丝氨酸蛋白酶的基因构建菌株BL21/pET-Sapr。通过对融合蛋白的诱导表达：确定最佳时间为4h，最佳温度为25℃，通过对粗酶液的脱脂牛乳平板定性分析表明具有生物学活性。(2)通过硫酸铵分级沉降及离子柱层析交换等步骤对粗酶液中丝氨酸蛋白酶进行纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳分析达到纯化要求，与纯化前的粗酶液相比，酶活力提高了15.1倍，达到322U/mg，但回收率仅为2.8%，同时确定丝氨酸蛋白酶的最适温度为70℃，最适pH为9.0。(3)通过SPI分散性指标，确定单因素实验最适的反应条件：底物浓度为8%，酶解时间为1h，酶解温度为70℃，酶解pH为9.0，酶活浓度为4000U/g。以加酶量、底物浓度、温度、pH值为自变量，以分散度为指标，通过四元二次正交旋转组合及响应面的分析，确定最优酶解反应条件：加酶量为4070U/g、底物浓度6.0%、反应温度71℃、反应pH9.0，此条件下的分散度为12.78。(4)通过单因素实验添加不同比例的改性SPI，利用配方奶粉的溶解性、润湿性、分散性和小白点数量的检测指标确定添加3%的改性大豆分离蛋白替代部分脱盐乳清粉，接近人体吸收的氨基酸模式，各项指标均符合检测要求。并通过添加改性SPI与添加未改性SPI的配方奶粉指标进行对比，改性后的SPI各项指标均明显高于添加未改性SPI的配方奶粉。