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类风湿性关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎症和软骨破坏为主的、系统性的自身免疫性疾病。动物RA虽然致死率不高,但难以治愈,导致养殖效益降低。有大量研究表明,小干扰RNA(siRNA)在体内可通过抑制目标基因的表达,有效治疗相关疾病。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化能力及归巢特性,可从多个环节参与免疫调节,促进损伤修复,而用于免疫性疾病的治疗。本研究运用RA大鼠模型,在探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达量与RA发生发展关系的基础上,采用siRNA体内转染抑制TNF-α过表达,同时进行BMSCs体内移植,研究siRNA基因联合BMSCs移植治疗RA的可行性及其机制。1.类风湿性关节炎大鼠模型优化及部分发病机制研究实验以胶原诱导(CIA组)和冷水浴+胶原诱导(冷水浴+CIA组)两种方案制备大鼠RA模型,CIA组于背部、尾根分点皮内注射鸡Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂乳化液,冷水浴+CIA组同前法注射,辅以持续1 w冷水游泳。同时设置正常对照(对照组),皮内注射等量生理盐水。根据大鼠生长发育、行为学、影像学和病理学等指标,筛选出稳定RA模型的制备方案。通过监测模型大鼠血清白细胞介素1β(IL-1β)及TNF-α、踝关节骨组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)及组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1),分析RA的发病机制,深入探究TNF-α在RA发生发展中的意义。结果显示,造模组大鼠体重增长缓慢,其中冷水浴+CIA组更显著;足趾部肿胀严重,踝关节及膝关节僵直不能弯曲。造模组大鼠脾脏脏器指数均极显著高于对照组(P<0.01),且冷水浴+CIA组极显著高于CIA组(P<0.01);造模组大鼠强迫游泳不动时间均极显著高于对照组(P<0.01);冷水浴+CIA组鼠膝关节出现RA典型的滑膜炎病变。模型鼠在造模第4、6 w血清IL-1β和TNF-α浓度均极显著高于对照组(P<0.01),第6 w时冷水浴+CIA组极显著高于CIA组;造模组大鼠MMP-9蛋白表达量较对照组上升,TIMP-1蛋白表达量较对照组下降,而CIA组与对照组差异显著(P<0.05),且冷水浴+CIA组与对照组差异极显著(P<0.01)。说明采用Ⅱ型胶原诱导辅以冷水游泳成功制备出稳定的RA大鼠模型;且随病程发展TNF-α升高,TNF-α是RA发生发展的重要因子。2.TNF-α-siRNA干扰BMSCs中TNF-α表达的体外研究针对RA大鼠血清TNF-α含量显著上升的结果,提示通过抑制机体TNF-α的分泌有望治疗RA。本实验首先在体外以不同浓度脂多糖(LPS)刺激大鼠BMSCs表达TNF-α,建立RA炎症反应的体外细胞模型;再利用siRNA干扰技术抑制TNF-α表达,进而筛选出针对TNF-α的最佳siRNA序列。LPS刺激BMSCs的结果显示,10 μg/mL LPS组细胞上清及裂解物中TNF-α量极显著高于未处理BMSCs组(P<0.01)。通过荧光强度比较,筛选出120 nM siRNA与1.5 μ1转染试剂组合为siRNA的最佳转染条件。siRNA转染BMSCs后,LPS+BMSCs+siRNA494、LPS+BMSCs+siRNA504、LPS+BMSCs+siRNA564 组细胞上清中 TNF-α 浓度分别为 278.71±6.25 pg/mL、247.96±5.72 pg/mL、283.21±5.56 pg/mL,均极显著低于 LPS+BMSCs 组(P<0.01),其中 LPS+BMSCs+siRNA504 组 TNF-α 浓度不仅极显著低于LPS+BMSCs组且极显著低于未处理BMSCs组(P<0.01)。结果显示,3条候选siRNA序列均可抑制BMSCs分泌TNF-α,其中siRNA504组效果最佳。提示10μg/mL LPS刺激BMSCs后成功模拟出RA炎性反应;siRNA504为TNF-α的最佳干扰序列。3.TNF-α-siRNA联合BMSCs对类风湿关节炎模型大鼠的治疗研究利用TNF-α-siRNA504体内转染联合BMSCs移植治疗RA模型大鼠,根据大鼠体重变化、足趾肿胀、强迫游泳、血清IL-1β及TNF-α的含量、骨组织中MMP-9及TIMP-1蛋白表达量等指标变化,探究单纯基因、细胞治疗和基因联合细胞治疗对RA的治疗效果。结果显示,所有治疗组大鼠体重增长较假治疗PBS组均极显著升高(P<0.01),其中TNF-α-siRNA504+BMSCs组体重增长最明显;足趾肿胀值由低到高依次为TNF-α-siRNA504+BMSCs 组、TNF-α-siRNA504 组、BMSCs 组、甲氨蝶呤组、PBS 组;治疗组大鼠强迫游泳不动时间均极显著低于PBS组(P<0.01),且TNF-α-siRNA504+BMSCs组极显著低于其他治疗组(P<0.01);治疗4w后大鼠血清IL-1β及TNF-α浓度显著下降,TNF-α-siRNA504+BMSCs 组分别下降至 27.13±2.83 pg/mL、209.85±5.83 pg/mL,极显著低于其他治疗组(P<0.01);与PBS组大鼠相比,各治疗组大鼠MMP-9蛋白表达均极显著降低(P<0.01),BMSCs、甲氨蝶呤、TNF-α-siRNA504、TNF-α-siRNA504+BMSCs组依次降低,而TIMP-1蛋白表达依次升高。说明3种治疗方案对RA均有效果,而TNF-α-siRNA504联合BMSCs移植优于siRNA、BMSCs单独治疗的效果。提示体内基因转染联合细胞移植可作为RA的重要治疗策略。