鹅源禽流感病毒株的分离鉴定及其致病性实验研究

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禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的禽类毁灭性疾病。高致病性禽流感被国际兽医局(OIE)定为A类传染病。该病自1878年首次报道以来,世界上许多国家和地区均有发生,AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。特别是禽流感病毒H5N1亚型于1997年、H9N2亚型于1999年、H7N7亚型于2003年和H5N1亚型于2004年先后发生感染人的事件,使得人们更加关注禽流感的公共卫生意义。本研究经过病毒分离从某鹅厂送检患病鹅咽喉泄殖腔棉拭子样品中分离到1株鹅源禽流感病毒,经负染后用电子显微镜观察,可见球形,外被囊膜的病毒颗粒。经HI和NI试验和荧光RT-PCR技术初步鉴定为H5亚型禽流感病毒。经过ELD50、IVPI、ICPI和致病性试验结果表明,分离到的鹅源毒株(G7)为H5N1亚型高致病性禽流感病毒株,经过理化特性试验可知:G7株为热不稳定性,56℃30min、60℃10min和65-70℃3min即可被灭活。鹅源禽流感病毒分离株(G7)对乙醚、氯仿和酸均敏感。根据GeneBank中已知的基因序列,设计合成1对用于扩增H5N1亚型血凝素(HA)基因的特异性引物。提取病毒基因组总RNA,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出G7的基因片段,并将其连接到载体pMD18-T上,转化到感受态细胞中,提取质粒,进行PCR和酶切鉴定及其序列测定。结果表明:扩增和克隆出G7的HA基因片段,HA基因阅读框基因全长1707bp,编码568个氨基酸。HA1、HA2的裂解位点附近有连续6个碱性氨基酸(RRRKKR)的插入,为高致病性AIV的分子特征。在HA肽链上有6个潜在的糖基化位点。受体结合位点相对应的氨基酸分别为YWIHELY,左侧壁氨基酸为SGVSS,右侧壁氨基酸为NGQSG。决定宿主特异性的受体结合位点226位和228位氨基酸具有与禽类细胞受体结合特异性。将G7株与参考毒株HA基因进行同源性比较,结果表明:G7与参考株之间HA基因的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.3%~99.1%和94.6%~98.8%。通过G7与各地区代表株之间的HA基因的同源性比较及遗传演化分析可知:同一亚型毒株同源性比较高,没有明显宿主和地域差异。用鹅源H5N1亚型AIV(G7)株对非免疫鸡进行滴鼻点眼、肌肉注射、静脉注射三种途径攻毒,攻毒后18-196h可以从咽喉、泄殖腔拭子中分离到病毒。攻毒后24-240h内可以从心、肝、脾脏、肺脏、肾脏、脑和肌肉等脏器利用荧光RT-PCR及免疫荧光检测到病原,结果表明该毒株对鸡有较强的致病性,病毒抗原在各部位定植时间不同。借助病理组织学方法,初步探讨鹅源禽流感病毒H5N1对家禽的致病机理。结果发现,G7对鸡具有高致病力,病毒引起心冠状脂肪严重出血、心肌纤维肿胀,坏死;肺脏充血、水肿表现明显;而且肾、肝、胰、脾、胸腺等均发生充血、出血、变性以及坏死等病变。
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