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背景与目的
癫痫是常见的以脑部神经元异常或同步放电为特征的神经系统疾病。癫痫的病因十分复杂，发病机制和病理改变目前尚未完全清楚。癫痫的治疗以抗癫痫药物为主。然而，即使经过合理规范的药物治疗，仍然有30%左右的患者癫痫发作控制不佳，发展为难治性癫痫。癫痫的频繁发作不但给患者带来了极大的痛苦，还给家庭和社会造成了沉重的负担。寻找新的治疗靶点，提高癫痫的治疗效果需要对癫痫进行更深入的研究。
烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)是一种在进化中保守的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)合成酶。人和小鼠中的NMNAT有三种亚型，其中NMNAT2主要在神经元中表达，定位于高尔基体和突触末端。NMNAT2还可同时发挥分子伴侣功能。多项研究表明NMNAT2的正常表达对生长发育和维持神经元正常功能具有重要作用。然而，NMNAT2蛋白水平上调在神经系统中的作用还存在争议。有研究发现通过慢病毒过表达NMNAT2可引起小鼠原代皮质神经元死亡，其中具体的机制尚不清楚。
目前关于NMNAT2在癫痫中的作用尚未见报道。本实验首先检测癫痫持续状态后小鼠海马NMNAT2的表达水平和定位分布的改变，接下来通过探索NMNAT2对癫痫易感性和神经元存活的影响以及可能的分子机制，为癫痫病理生理的研究和寻找新的治疗靶点提供新的思路。
方法
1.建立小鼠匹鲁卡品癫痫模型，通过免疫印迹和免疫荧光分别检测癫痫持续状态(SE)后不同时间点海马中NMNAT2的表达变化和NMNAT2在海马中的定位分布。
2.通过腺相关病毒立体定位注射技术在小鼠双侧海马CA1区过表达NMNAT2，检测NMNAT2蛋白水平上调对小鼠癫痫易感性的影响。
3.通过尼氏染色和Fluoro-JadeC染色，检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下和SE发作后48小时神经元的存活和损伤情况。
4.应用免疫印迹检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后凋亡相关蛋白的表达变化。构建NMNAT2不同结构域突变的质粒并转染Hela细胞，通过CCK-8和免疫印迹检测过表达NMNAT2引起的凋亡相关蛋白的改变与NMNAT2哪个结构域相关。
5.应用免疫印迹检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后SOD2、Sirt3、FoxO3a的表达变化。将NMNAT2不同突变体质粒转染Hela细胞，通过免疫印迹检测过表达NMNAT2引起的上述蛋白改变与NMNAT2哪个结构域相关。
结果
1.免疫印迹结果显示从SE后1天到60天，小鼠海马NMNAT2的蛋白水平升高；免疫荧光结果显示在正常生理条件下和SE后3天，海马CA区的荧光强度较强，而齿状回的荧光强度较弱；但在SE后14天和60天，海马CA区和齿状回的荧光强度均较强。
2.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2明显缩短了SE的潜伏期，并显著提高了SE的发作率和死亡率。尼氏染色显示海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下即有CA1区神经元数目的明显减少；FJC染色显示海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下CA1区即已出现FJC染色阳性细胞。
3.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后Bcl-2蛋白水平降低，CleavedCaspase3水平升高。CCK-8结果显示过表达NMNAT2及其突变体不会影响Hela细胞的存活；然而免疫印迹结果显示过表达NMNAT2野生型、酶活性突变型和定位突变型会引起Hela细胞CleavedCaspase3水平升高，但过表达NMNAT2分子伴侣突变型不会引起CleavedCaspase3水平明显变化。
4.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后SOD2和Sirt3的表达水平降低。并且在Hela细胞中过表达NMNAT2野生型、酶活性突变型和定位突变型会引起SOD2乙酰化水平升高，但过表达NMNAT2分子伴侣突变型不会引起Hela细胞SOD2乙酰化水平明显变化。
5.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2不但在正常生理条件下引起FoxO3a的表达水平升高，还会加重癫痫持续状态诱导的FoxO3a蛋白水平的上调和转录活性的增强。
结论
1.癫痫持续状态后，小鼠海马NMNAT2的蛋白水平升高，并且NMNAT2在海马中的分布随癫痫的进展发生改变。
2.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2可增强癫痫易感性，并在正常情况下即能造成CA1区神经元的损伤和丢失，但尚不能认为加重了SE导致的神经元损伤。
3.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2促进了神经元的凋亡，这种促凋亡作用可能与NMNAT2分子伴侣功能相关。
4.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2引起的SOD2和Sirt3表达水平的下降以及FoxO3a表达水平的上调可能是其造成神经元损伤的分子机制。
癫痫是常见的以脑部神经元异常或同步放电为特征的神经系统疾病。癫痫的病因十分复杂，发病机制和病理改变目前尚未完全清楚。癫痫的治疗以抗癫痫药物为主。然而，即使经过合理规范的药物治疗，仍然有30%左右的患者癫痫发作控制不佳，发展为难治性癫痫。癫痫的频繁发作不但给患者带来了极大的痛苦，还给家庭和社会造成了沉重的负担。寻找新的治疗靶点，提高癫痫的治疗效果需要对癫痫进行更深入的研究。
烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)是一种在进化中保守的NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)合成酶。人和小鼠中的NMNAT有三种亚型，其中NMNAT2主要在神经元中表达，定位于高尔基体和突触末端。NMNAT2还可同时发挥分子伴侣功能。多项研究表明NMNAT2的正常表达对生长发育和维持神经元正常功能具有重要作用。然而，NMNAT2蛋白水平上调在神经系统中的作用还存在争议。有研究发现通过慢病毒过表达NMNAT2可引起小鼠原代皮质神经元死亡，其中具体的机制尚不清楚。
目前关于NMNAT2在癫痫中的作用尚未见报道。本实验首先检测癫痫持续状态后小鼠海马NMNAT2的表达水平和定位分布的改变，接下来通过探索NMNAT2对癫痫易感性和神经元存活的影响以及可能的分子机制，为癫痫病理生理的研究和寻找新的治疗靶点提供新的思路。
方法
1.建立小鼠匹鲁卡品癫痫模型，通过免疫印迹和免疫荧光分别检测癫痫持续状态(SE)后不同时间点海马中NMNAT2的表达变化和NMNAT2在海马中的定位分布。
2.通过腺相关病毒立体定位注射技术在小鼠双侧海马CA1区过表达NMNAT2，检测NMNAT2蛋白水平上调对小鼠癫痫易感性的影响。
3.通过尼氏染色和Fluoro-JadeC染色，检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下和SE发作后48小时神经元的存活和损伤情况。
4.应用免疫印迹检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后凋亡相关蛋白的表达变化。构建NMNAT2不同结构域突变的质粒并转染Hela细胞，通过CCK-8和免疫印迹检测过表达NMNAT2引起的凋亡相关蛋白的改变与NMNAT2哪个结构域相关。
5.应用免疫印迹检测小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后SOD2、Sirt3、FoxO3a的表达变化。将NMNAT2不同突变体质粒转染Hela细胞，通过免疫印迹检测过表达NMNAT2引起的上述蛋白改变与NMNAT2哪个结构域相关。
结果
1.免疫印迹结果显示从SE后1天到60天，小鼠海马NMNAT2的蛋白水平升高；免疫荧光结果显示在正常生理条件下和SE后3天，海马CA区的荧光强度较强，而齿状回的荧光强度较弱；但在SE后14天和60天，海马CA区和齿状回的荧光强度均较强。
2.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2明显缩短了SE的潜伏期，并显著提高了SE的发作率和死亡率。尼氏染色显示海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下即有CA1区神经元数目的明显减少；FJC染色显示海马CA1区过表达NMNAT2后在正常生理条件下CA1区即已出现FJC染色阳性细胞。
3.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后Bcl-2蛋白水平降低，CleavedCaspase3水平升高。CCK-8结果显示过表达NMNAT2及其突变体不会影响Hela细胞的存活；然而免疫印迹结果显示过表达NMNAT2野生型、酶活性突变型和定位突变型会引起Hela细胞CleavedCaspase3水平升高，但过表达NMNAT2分子伴侣突变型不会引起CleavedCaspase3水平明显变化。
4.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2后SOD2和Sirt3的表达水平降低。并且在Hela细胞中过表达NMNAT2野生型、酶活性突变型和定位突变型会引起SOD2乙酰化水平升高，但过表达NMNAT2分子伴侣突变型不会引起Hela细胞SOD2乙酰化水平明显变化。
5.免疫印迹结果显示小鼠海马CA1区过表达NMNAT2不但在正常生理条件下引起FoxO3a的表达水平升高，还会加重癫痫持续状态诱导的FoxO3a蛋白水平的上调和转录活性的增强。
结论
1.癫痫持续状态后，小鼠海马NMNAT2的蛋白水平升高，并且NMNAT2在海马中的分布随癫痫的进展发生改变。
2.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2可增强癫痫易感性，并在正常情况下即能造成CA1区神经元的损伤和丢失，但尚不能认为加重了SE导致的神经元损伤。
3.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2促进了神经元的凋亡，这种促凋亡作用可能与NMNAT2分子伴侣功能相关。
4.小鼠海马CA1区过表达NMNAT2引起的SOD2和Sirt3表达水平的下降以及FoxO3a表达水平的上调可能是其造成神经元损伤的分子机制。