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大片吸虫病(Fasciolosis)是一种常见的水牛寄生虫病,了解水牛免疫细胞的各种特性,是防御水牛大片吸虫病的基础。研究一:为选择适宜的实验动物,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选大片吸虫阴性的9、15和24月龄的水牛各5头。对所有实验动物的外周血细胞进行总数计数和分类计数,同时分离出不同月龄(9、15和24月龄)健康水牛外周血单个核细胞(PBMC),与不同浓度的非特异刺激因子植物血凝素(PHA)和刀豆素A(ConA)(0.125、0.25、0.5、1、2、3、4μg/孔)进行培养,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)测定增殖能力,计算刺激指数(SI)。白细胞总数计数和分类计数实验结果表明,9、15和24月龄组外周血细胞总数分别是17.1×10~9个/ml、16.4×10~9个/ml和16.5×10~9个/ml;其中淋巴细胞分别为9.7×10~9个/ml、9.1×10~9个/ml和7.9×10~9个/ml;嗜酸性粒细胞分别为0.3×10~9个/ml、0.1×10~9个/ml和0.3×10~9个/ml。白细胞分类计数和总数计数在不同月龄水牛间的差异不显著。细胞增殖实验结果表明:9、15和24月龄组在PHA刺激下(0.125～3.000μg/孔)SI随PHA浓度的升高而增高,分别为1.3～3.3、1.0～3.0和1.5～3.6。各月龄组水牛细胞在ConA刺激下(0.125～4μg/孔)的SI随ConA浓度的升高而增高,分别为1.0～1.5、1.1～1.6和1.0～1.6。PHA或ConA刺激下的SI在不同月龄水牛间差异也不显著。这提示9、15、24月龄水牛均适宜用作进一步的实验。PHA刺激下的SI和ConA刺激下的SI在同一月龄水牛组内差异显著(P＜0.05),且PHA刺激下的SI比ConA刺激下的SI高。研究二:为了了解非特异性刺激原(ConA、PHA、LPS)和FgESP对水牛PBMC表达IFN-γ和IL-10的水平的影响,及FgESP对各刺激因子的调节作用。从水牛胆囊中收集大片吸虫成虫并制备大片吸虫分泌排泄产物(FgESP)。应用FgESP和非特异性刺激原(ConA、PHA、LPS)刺激15月龄水牛外周血单个核细胞,实验设有ConA、PHA、LPS、FgESP、FgESP+LPS、FgESP+ConA和FgESP+PHA 7个实验组,并设有阴性对照。采用ELISA方法检测各实验组及阴性对照组在各刺激原刺激6、12、24和48小时(h)下PBMC表达IFN-γ和IL-10的浓度,比较各组实验在不同时间段IFN-γ和IL-10的水平。结果显示ConA、PHA和LPS三者均于6h刺激水牛PBMC产生IFN-γ。PHA刺激细胞产生IFN-γ出现的峰值最早(6h,83.41 pg/ml),ConA刺激细胞产生IFN-γ出现的峰值最晚(24h,87.76 pg/ml)。ConA、PHA和LPS三者在各时间段刺激细胞产生的IL-10都较少,与阴性对照比较差异不显著。在ConA、PHA和LPS三组中,ConA刺激PBMC产生的IFN-γ最强(24h峰值,87.76 pg/ml),LPS刺激PBMC产生的IFN-γ最弱(6h峰值,47.5 pg/ml)。ESP单独刺激PBMC检测到的IFN-γ和IL-10都较少,与阴性比较差异都不显著。FgESP+ConA、PHA+FgESP和FgESP+LPS三组实验分别与ConA、PHA和LPS三组实验相比,的IFN-γ区别都不明显。FgESP+ConA和PHA+FgESP两组实验分别与ConA和PHA实验组相比,IL-10都明显升高(P＜0.05),升高的最高指数都在24h,分别为2.91和2.92;FgESP+LPS实验组与LPS比较,IL-10区别不明显。实验结果表明健康水牛PBMC对ConA和PHA抗原比较敏感,且在ConA刺激下产生IFN-γ量较大,这为今后大片吸虫疫苗设计奠定了基础;在FgESP的调节作用下,ConA和PHA刺激PBMC产生的IL-10升高明显,且升高指数都在24h。FgESP对PBMC这一免疫调节特征为今后的大片吸虫防治打下基础。