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目的:人巨细胞病毒(HCMV)是一种全球性易感病毒,属于β疱疹病毒科。人体免疫功能受损后,病毒感染状态由潜伏感染转变为激活感染,从而使感染人群出现多种并发症,严重时会导致机体功能失调乃至死亡。HCMV的致病机制尚不清楚,但HCMV UL/b’区基因多态性的广泛研究揭示,此基因结构区域是HCMV致病性的遗传基础。UL/b’区包括UL133-UL151这19个基因,根据UL/b’区在HCMV感染机制中的重要作用,可以推断该基因结构区域中的UL147A基因在病毒的复制、潜伏及对机体的致病性方面可能起着重要作用,而且还可能影响宿主的多种免疫调节机制。然而目前鲜少有关于UL147A基因功能的研究报道,因此本研究制备的人巨细胞病毒pUL147A多克隆抗体将有助于进一步发现UL147A基因的结构和功能,为HCMV感染机制的深入研究奠定基础。方法:本研究包括两部分内容:(1)UL147A重组蛋白的表达与纯化:先以HCMV Towne EL-350为模板,扩增UL147A基因,然后构建pET32a(+)-UL147A重组质粒,再转化大肠杆菌DH5α,进行pET32a(+)-UL147A重组质粒的克隆,经过一系列实验鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),进行UL147A重组蛋白的表达。优化诱导表达条件后,收集大量UL147A重组蛋白,进行Ni-NTA亲和纯化,优化纯化条件以获得高纯度UL147A重组蛋白。(2)pUL147A多克隆抗体制备:将纯化后的UL147A重组蛋白与佐剂混合形成抗原,免疫新西兰白兔,ELISA法测效价,效价达到10~5后,取兔抗血清,并用硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化得到pUL147A多克隆抗体,最后进行Western blot以验证该抗体特异性。结果:(1)UL147A重组蛋白的表达与纯化:成功构建了pET32a(+)-UL147A重组质粒,并使UL147A重组蛋白得以在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。该重组蛋白以包涵体形式表达,优化诱导表达条件后,发现其最佳IPTG诱导浓度为1.0mM、最佳诱导时间为10 h、最佳诱导温度为25℃。收集大量该重组蛋白并进行Ni-NTA亲和纯化,优化纯化条件后,发现在用含不同浓度咪唑缓冲液洗脱蛋白样品时,含150 mM咪唑缓冲液洗脱效果最好,能得到较高纯度的UL147A重组蛋白。(2)pUL147A多克隆抗体制备:兔抗血清纯化后,经ELISA检测,效价≥10~5,经Western blot验证分析得到,pUL147A多克隆抗体特异性良好。结论:(1)成功构建了UL147A重组蛋白原核表达体系,并获得高纯度的UL147A重组蛋白。(2)成功制备了纯度较高、特异性良好的pUL147A多克隆抗体。