脑创伤是神经科的常见疾病，发病率极高，目前人们已经清楚其病理学改变包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段，由于原发性损伤的不可逆性，采取多种手段减轻继发性损伤，促进脑损伤及其周围区神经细胞的存活和功能恢复，对于改善病人的预后非常重要。目前研究证实中枢神经继发性损伤的发病机制主要是：由脑损伤区局部水肿、缺血、缺氧，电解质紊乱，自由基和过氧化脂质的生成，兴奋性氨基酸、炎性因子和一氧化氮的毒性作用等所导致的神经细胞凋亡和坏死。近期有研究证实在中枢神经损伤后损伤周围区出现高浓度的三磷酸腺苷(ATP)聚集，并参与继发性神经细胞凋亡或坏死。ATP是传统的能量物质，在细胞线粒体产生，释放到胞浆内发挥作用。正常情况下细胞外含量很低。Wang xiaohai报道在脊髓损伤后ATP在损伤周围区存在高浓度聚集，诱导脊髓神经细胞凋亡。Chen ming研究证实脑外伤后，损伤周围区．ATP P2X<,1>、P2X<,4>、P2X<,7>受体表达上调，ATP通过作用于小胶质细胞膜上的P2X离子通道型受体，使小胶质细胞活化释放炎性介质及细胞因子继而引起神经元损伤。在缺血或缺氧等病理条件下，嘌呤核苷酸也会从死亡细胞中释放至细胞外并达到高浓度，如Franke将大脑皮质脑片在低氧条件(95﹪N<,2>,5﹪CO<,2>)下培养30分钟，可引起细胞形态学的变化，若提前加入ATPP2X受体阻断剂PPADS，则可阻止细胞死亡，提示P2受体参与了此过程。ATP及P2受体也参与并介导了神经元退行性疾病。阿耳茨海默(氏)病(AD)是一种细胞外β淀粉样肽类物质的进行性沉积过程，可以引起神经元的损伤最终导致细胞功能紊乱而死亡。ATP铝盐能促进β淀粉样蛋白的形成，这一反应可以被ATP受体阻断剂suramin阻断。ATP还可以调控中枢神经系统多巴胺能神经递质的传递。ATP通过作用于P2Y受体，促进从黑质致密部投射到纹状体的神经末稍释放多巴胺。以上研究证实ATP在中枢神经系统多种疾病的病理生理机制中发挥重要作用，然而目前有关ATP对神经系统创伤性损伤后神经细胞作用的报道并不一致，其病理生理学机制也不十分清楚。我们推测ATP对神经细胞作用的多样复杂性与其作用浓度，以及通过不同的信号转导通路相关。另外，ATP对神经细胞的损伤可能通过两种方式即直接损伤与间接损伤进行。直接损伤是指ATP通过直接作用于神经细胞或神经胶质细胞表面的受体造成神经细胞的死亡；间接损伤是ATP首先作用于神经胶质细胞尤其是小胶质细胞表面的受体，造成小胶质细胞活化，释放大量炎性因子，进而引起神经细胞死亡。通过上述两条途径ATP参与了中枢神经损伤的继发性损伤过程。因此深入细致研究内、外源性ATP对中枢神经系统生长发育和损伤修复中的作用、分子机制和防治措施具有重要的医学理论意义和临床应用价值。 本工作在体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞实验模型上，应用显微镜观察、MTT细胞活性测定、NSE和cleaved caspase-3免疫细胞化学，以及hoechst荧光细胞化学染色等方法，着重研究ATP直接导致胚胎大鼠皮层神经细胞死亡作用的剂量和时间依赖性，初步证实了活化的caspase-3参与ATP致细胞死亡的机制，并探讨了ATP P2受体阻断剂苏拉明(suramin)及神经生长因子(NGF)在ATP致神经细胞损伤后增加细胞存活率的神经保护作用。 实验结果如下： 一、不同浓度ATP对培养的胚胎大鼠皮层神经细胞的作用及诱导细胞死亡的剂量依赖性本工作利用倒置显微镜观察、MTT细胞活性测定和NSE免疫细胞化学的方法，研究了不同浓度．ATP溶液对体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞的细胞活性、形态学以及NSE阳性神经元的影响。结果发现： (1)不同浓度．ATP(0.1、1、5、10、100 mmol/L)．溶液作用于细胞12 h，MTT法测定细胞活性分别为正常对照组的102﹪、100﹪、73﹪、59﹪、34﹪。5、10、100 mmol/LATP组细胞存活率较对照组相比，存在显著性差异(P<0.05)。 (2)上述不同浓度ATP溶液作用于细胞24 h，倒置显微镜下观察大脑皮层神经细胞形态学变化和活细胞计数发现，正常生长的大脑皮层神经细胞呈椭圆形，胞体饱满，边界清晰，周围有光晕，细胞之间形成网状的突触联系，活细胞数量为73.91±7.162个；0.1mmol/L，ATP组活细胞计数为74.20±4.022个，其细胞形态学与正常对照组比较，无显著性差异；5 mmol/LATP组细胞数量减少，活细胞计数为35.45±5.410个，同时细胞体积减小，多呈圆球状，突起断裂，细胞之间的突触联系明显减少；10 mmol/L ATP组细胞数量继续减少，活细胞计数为30.10±5.724.个，突起断裂，死亡细胞碎片聚集成团；100 mmol/L ATP组活细胞计数为19.90±1.633个，死亡细胞碎片继续增多。经统计学检验，5、10、100 mmol/L ATP活细胞计数与对照组比较存在非常显著性差异(P<0.01)。 (3)不同浓度.ATP溶液作用于细胞24 h，NSE阳性神经元细胞数呈浓度依赖性减少，对照组为72.80±7.099个，0.1、5、10、100 mmol/L ATP溶液组NSE阳性神经元分别为75.00±6.667个、31.14±7.574个、26.00±6.716个、15.20±3.824个。 5、10、100 mmol/L ATP组与对照组相比，存在非常显著性差异(P<0.01)。以上结果提示5、10、100 mmol/L ATP溶液可以呈剂量依赖性地导致体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞死亡，主要表现为细胞皱缩、聚集成团和突起断裂。 二、不同浓度ATP对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经细胞的作用我们应用倒置显微镜观察和NSE免疫细胞化学的方法研究了不同浓度ATP溶液对体外培养的胚胎大鼠脊髓神经细胞的形态学以及NSE阳性神经元的影响。结果发现： (1)不同浓度ATP(0.1、10、100 mmol/L)溶液作用于细胞24 h，显微镜下活细胞计数显示：对照组为56.94±3.60个，0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用组为58.20±3.40个、32.45±1.31个、17.89±1.63个。10、100 mmol/L ATP溶液作用组与对照组相比，存在非常显著性差异(P<0.01)。 (2)不同浓度0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用于细胞24 h，计算NSE阳性神经元细胞数量发现：对照组为54.64±5.61个，0.1、10、100 mmol/L ATP溶液作用组为55.00±6.67个、36.64±9.83个、17.28±4.89个。 10、100 mmol/L ATP作用组与对照组相比，存在非常显著性差异(P<0.01)。以上结果提示10、100 mmol/L ATP溶液可以呈剂量依赖性地导致体外培养的胚胎大鼠脊髓神经细胞死亡。 三、凋亡蛋白caspase-3活化机制参与ATP致体外培养的胚鼠皮层神经细胞凋亡过程细胞死亡包括坏死和凋亡两种方式。为探讨ATP致胚胎大鼠皮层神经细胞死亡的性质，我们进行了Hoechst 33258荧光细胞化学染色。Hoechst 33258是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞与富含AT区的DNA特异性结合。用紫外光作为激发光，被标记的正常DNA发出朦胧蓝色荧光，而凋亡细胞由于染色质凝聚呈亮而致密的荧光。本实验结果发现：细胞培养第5 d，培养液中加入5、10、100 mmol/L ATP作用皮层神经细胞6 h，Hoechst 33258凋亡阳性细胞数在200倍视野下对照组为5.00±2.617个，5、10、100 mmol/L ATP溶液作用组凋亡阳性细胞数分别为14.00±2.927个、22.00±6.880个、26.20±9.576个，与对照组间存在非常显著性差异(P<0.01)。提示ATP可以诱导培养的胚胎大鼠皮层神经细胞凋亡。 四、ATP P2受体调制ATP诱导体外培养的胚鼠皮层神经细胞死亡中枢神经系统内广泛存在着ATP受体。目前发现的ATP受体主要有P2X和P2Y两个亚型。P2X为离子通道型受体，P2Y是G蛋白偶联代谢型受体。目前P2X受体亚型在哺乳动物已克隆出7种，为P2X<,1-7>,P2Y受体克隆出8种，为P2Y<,1，2，4，6，11，12，13，14>。suramin是一种水溶性的化合物，其分子式为C51H34N6O23Na6S6，分子量为1429。研究表明，suramin能够拮抗P2X受体的作用，也可拮抗除P2Y4外多数P2Y受体。 以上各项实验结果我们得出下面结论： 1. 中、高浓度ATP可以诱导体外培养的胚胎大鼠皮层和脊髓神经细胞死亡。 2．细胞凋亡蛋白caspase-3活化参与ATP诱导体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞凋亡过程。 3．ATP P2受体调控机制参与ATP诱导体外培养的胚胎大鼠皮层细胞死亡过程。 4．苏拉明可以部分阻断ATP诱导的体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞死亡。 5．神经生长因子具有减轻ATP诱导的体外培养的胚胎大鼠皮层神经细胞死亡的神经细胞保护作用。