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本文采用电子克隆结合RT-PCR方法,克隆了普通小麦的5个受环境胁迫因子诱导的基因,分别命名为TaZnF、TaSrg6、TaNAC03、TaNAC06以及TaNACll;序列分析表明,TaZnF基因编码由165个氨基酸组成的蛋白质,并在N端和C端分别包含两个保守的锌指蛋白结构域(A20锌指和AN-1锌指);TaSvg6基因编码由366个氨基酸组成的包含螺旋-环-螺旋结构域蛋白质;TaNAC03、TaNAC06以及TaNACll,基因分别编码由858个、897个和984个氨基酸组成的N端包含NAC转录因子家族所共有的NAC(NAM,ATAF和CUC2)结构域的蛋白质。在洋葱表皮细胞内瞬时表达实验证明,TaZnF、TaSrg6、TaNAC03、TaNAC06以及TraNACll与GFP的融合蛋白聚集在细胞核内,证明了上述5个基因编码的蛋白是核蛋白。另外,我们克隆了TaZnF基因的启动子区域,并分析了该区域的顺式作用成分,发现在TaZnF基因的启动子区包含着许多与生物和非生物胁迫有关的顺式作用成分。此外,通过电子克隆的方法,我们共得到了27个编码保守NAC结构域的具有完整ORF的小麦NAC基因,编号分别为TaNAC01~TaNAC27。
上述的5个基因在小麦的根和叶中组成型表达,采用荧光实时定量PCR的方法,分别研究了这五个基因在PEG、高盐和低温胁迫条件下的诱导表达模式,以及它们对植物激素ABA的响应情况。结果表明,上述的五个基因在转录水平的表达受PEG、高盐和低温及ABA处理的诱导,这也暗示了它们可能会在逆境胁迫反应中起发挥相应地作用。
为了研究所克隆基因的生物学功能,通过农杆菌介导法分别获得了上述5个基因的超量表达转基因拟南芥株系。结果发现:有超过半数的TaNAC03超表达转基因株系的叶片在发育的初期发生了明显的形态学上的改变,但是在生长后期可以逐渐恢复正常;而TaNAC06超表达转基因株系在叶片和株高的形态学上的改变则是不可恢复的;同时TaNACll超表达转基因拟南芥叶片、茎和根的数目增多;这些结果说明了TaNAC03、TaNAC06以及TaNACll基因对植物的生长发育发挥着重要的调节作用。超表达TaZnF和TaSrg6基因的转基因株系在外部形态上并没有发生变化,但是超表达TaZnF’的转基因植株提高了对干旱、低温及高盐胁迫的能力,并使转基因植株中rd29A的基因上调表达;超表达TaSrg6的转基因植株提高了抗干旱的能力,同时使转基因植株中erdl基因上调表达;这些结果暗示了TaZnF和TaSrg6基因在参与逆境胁迫时可能具有的调控机制。另外,TaZnF与原核表达载体的融合蛋白在大肠杆菌中表达后,提高了大肠杆菌细胞的抗高渗、高盐和低温的能力,这也说明了TaZnF蛋白在原核细胞的逆境胁迫中也起到一定的作用。
总之,小麦的TaZnF、TaSrg6、TaNAC03、TaNAC06以及TaNACll基因编码具有调节功能的核蛋白,并受逆境胁迫因子PEG、高盐、低温和ABA的诱导,可能在小麦的生长、发育及逆境胁迫应答信号传导途径中发挥重要的作用。