研究背景妊娠期高血压疾病是严重危害孕产妇健康和造成胎婴儿死亡的重要疾病之一。虽然,在过去的二十年中,妊娠期高血压疾病的疗效得到很大的改善,对妊娠期高血压疾病的病因和病历生理改变有了更深的认识,但是,其病因和发病机制远未阐明,也没有特异性诊断方法,他们都制约着妊娠期高血压疾病的预防和其疗效的进一步完善。因此,妊娠期高血压疾病仍然是围产医学的长期且重要研究课题之一。近年来,随着医学基础理论特别是分子生物学的研究进展,生殖免疫逐渐成为国内外学者关注的热点。大量研究表明,妊娠期高血压疾病发病的中心环节为广泛的血管内皮损伤,其中,免疫因素起重要作用。正常妊娠的维持,有赖于母胎间免疫平衡的建立与稳定。非特异性免疫功能作为免疫功能的重要组成部分,在妊娠期间出现的各种活化表现已经开始逐步引起人们的重视。近年来,国外一些研究表明,非特异性免疫功能在妊娠期间明显增强。认为非特异性免疫功能可能是妊娠期间特异性免疫功能降低的一种补偿,在调节母体与胎儿之间关系中发挥重要作用。巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要组成部分,其不仅能够直接参与免疫活动,而且在过度激活下可产生大量炎性因子如TNF-α和IL-6等,并在许多疾病的病理变化中起关键作用。近年来,有关妊娠期高血压疾病发病机理的研究,倾向于将子痫前期的临床表现解释为母体炎症反应过度的结果。许多研究证实,在免疫应答过程中,巨噬细胞是一种很重要的抗原递呈细胞(APC)。作为炎症反应指征的巨噬细胞数量增多,可见于妊娠期高血压疾病患者的多种器官内。一旦妊娠期高血压疾病患者体内存在某种因素激活单核/巨噬细胞,将造成炎性细胞因子的大量释放,损伤血管内皮细胞,下调滋养细胞的侵入功能。上述实验研究结果表明巨噬细胞在妊娠期高血压疾病的发病上具有决定性作用。本课题选择腹腔巨噬细胞为研究对象,通过贴壁的方法对巨噬细胞进行分离、纯化,培养。采用生物学和免疫学技术对正常妊娠及妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-6、TGFβ1和CD54进行研究,探讨巨噬细胞在妊娠期高血压疾病中的作用,以及各项指标与妊娠期高血压疾病发病的关系。并采用山莨菪碱对体外培养中的巨噬细胞进行干预,探索其治疗妊娠期高血压疾病的机理,为临床应用提供依据。本研究目前国内尚未见报道。本研究内容包括三部分,现概述如下:第一部分TNF-α及TGF-β1 mRNA在妊娠期间腹腔巨噬细胞中的表达目的探讨TNF-α和TGF-β1 mRNA在正常妊娠腹腔巨噬细胞中的表达及其意义。方法采用RT-PCR方法研究10例正常足月妊娠和10例子宫肌瘤患者腹腔巨噬细胞TNF-α及TGF-β1 mRNA的表达。结果(1)足月妊娠组腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA与子宫肌瘤组相比表达显著增强(P<0.01)。(2)TGF-β1mRNA在足月妊娠孕妇腹腔巨噬细胞中的表达增强,两者比较有非常显著性差异(P<0.001)。结论妊娠可以刺激机体巨噬细胞活化,妊娠期间非特异性免疫功能增强。TNF-α及TGF-β1参与了妊娠期间免疫平衡的建立和稳定。第二部分妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞释放细胞因子的能力变化与CD54表达的研究目的通过研究妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞产生TNF-α、TGF-β1和IL-6的功能变化及CD54表达变化,以探讨它们在妊娠期高血压疾病发病机理中的作用。方法本研究采用双抗体夹心酶联免疫吸附法、RT-PCR、流式细胞术等方法,将妊娠期高血压疾病患者和正常孕妇腹腔液中的巨噬细胞体外培养,对腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α、TGFβ1和IL-6的浓度,腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA、TGFβ1 mRNA和IL-6 mRNA的表达及细胞表面CD54的表达进行了测定。结果(1)妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞培养上清液TNF-α、IL-6和TGF-β1的水平表明培养上清中TNF-α水平均明显高于对照组,其中,GH组与对照组相比有显著性差异(P<0.05),MP组、SP组与对照组相比有非常显著性差异(P<0.01),MP组、SP组与GH组相比有非常显著性差异(P<0.01);HDCP组IL-6水平明显高于对照组,MP组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)、SP组与对照组相比有非常显著性差异(P<0.01),SP组GH组相比有非常显著性差异(P<0.01);TGF-β1水平随着妊娠期高血压疾病病情进展而逐渐升高,SP组TGF-β1水平明显高于对照组(P<0.05),SP组与GH组、MP组相比有显著性差异(P<0.05)。(2)妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞TNF-a mRNA、TGF-β1mRNA和IL-6mRNA表明TNF-αmRNA表达水平均明显高于对照组,其中,GH组与对照组相比有显著性差异(P<0.05), MP、SP组与对照组相比有非常显著性差异(P<0.01),MP、SP组与GH组相比有非常显著性差异(P<0.01);TGF-B1mRNA表达SP组与MP组、GH组或对照组比较均有非常显著性差异(P<0.01);IL-6 mRNA表达GH组与对照组相比有显著性差异(P<0.05),MP、SP组与对照组相比有非常显著性差异(P<0.01),SP组与GH组相比有非常显著性差异(P<0.01)。(3)CD54在妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞上的表达:MP、SP组患者腹腔巨噬细胞CD54+细胞百分率较正常对照组明显增高,差异均有显著性(P<0.05);GH组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论(1)妊娠期高血压疾病患者体外培养腹腔巨噬细胞在翻译和转录两个水平高表达TNF-α、IL-6、TGF-β1,从另一方面证明妊娠期高血压疾病患者腹腔液中巨噬细胞的活性及分泌细胞因子的水平增加。说明妊娠期高血压疾病患者体内巨噬细胞处于高免疫激活状态,并参与了妊娠期高血压疾病的免疫学发病机制。(2)妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞在翻译和转录两个水平产生TNF-α显著增加,说明妊娠期高血压疾病时患者体内TNF-α的含量增加,过多TNF-α与妊娠期高血压疾病的发生密切相关。(3)腹腔巨噬细胞产生TGF-β1水平随妊娠期高血压疾病病情严重程度的增加而升高,重度子痫前期与正常妊娠相比差异有显著性。说明TGF-β1异常表达在妊娠期高血压疾病发病机理中起重要作用。(4)妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞在翻译和转录两个水平产生IL-6显著增加,导致内皮功能失调,参与了妊娠期高血压疾病的发病机制。(5)子痫前期腹腔巨噬细胞CD54+细胞百分率较正常妊娠明显增高,差异有显著性。且随着病情加重CD54+细胞百分率有增加趋势。说明细胞粘附分子异常表达在妊娠期高血压疾病发病机理中起重要作用。第三部分山莨菪碱对妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞分泌细胞因子的影响目的观察山莨菪碱(654-2)对妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的影响,探讨其对妊娠期高血压疾病治疗作用的免疫机制。方法分离提纯妊娠期高血压疾病患者腹腔巨噬细胞后分别用RPMI1640或含0.5mg/mL 654-2的RPMI1640培养液培养24h,应用ELISA方法和RT-PCR方法分别检测巨噬细胞培养上清液中TNF-α、IL-6水平及两者mRNA表达情况。结果(1)654-2可明显降低妊娠期高血压疾病各组巨噬细胞培养上清液中TNFα水平(P分别<0.05,0.01和0.01)。(2)654-2可明显降低MP组、SP组巨噬细胞培养上清液中IL-6水平(P分别<0.05和0.01)。(3)654-2可明显降低妊娠期高血压疾病各组巨噬细胞TNFαmRNA表达量(P分别<0.05,0.01和0.01)。(4)654-2可明显降低MP组、SP组巨噬细胞TNFαmRNA表达量(P分别<0.05和0.05)。结论654-2对妊娠期高血压疾病患者不仅具有解痉作用,同时对腹腔巨噬细胞过度活化具有显著抑制作用,可在转录和翻译两个水平抑制TNF-α、IL-6产生,在一定程度上防止妊娠期高血压疾病的发生和发展。