论文部分内容阅读
研究目的:1.建立从SD大鼠骨髓和人足月脐带分离间充质干细胞(MSCs)、体外传代培养方法,研究其在体外的生物学特性及表型特征,并对两种MSCs进行标记,为后续实验提供理想的细胞源。2.模拟人类妊娠、分娩损伤、去势后低雌激素与压力性尿失禁(SUI)发生的关系,建立SUI动物模型,将获得的标记细胞注射于大鼠后尿道周围,依据尿流动力学指标、喷嚏实验阳性率、尿道及其周围组织形态学改变,观察间充质干细胞移植治疗压力性尿失禁大鼠是否有效可行。材料和方法:1.SUI模型的建立:①实验组:受孕SD雌鼠分娩后立即麻醉,将14F的弗莱氏导尿管插入阴道2～3cm并用丝线固定于阴道口,往气囊内注入5ml生理盐水,维持此状态4h;两周后行双侧卵巢切除术,常规饲养两月后SUI模型建成。②阳性对照组:受孕SD雌鼠分娩后立即麻醉,将14F的弗莱氏导尿管插入阴道2～3cm并用丝线固定于阴道口,维持此状态4h,常规饲养两月。所有实验大鼠均用BL-410生物机能实验系统检测尿流动力学指标,再加上喷嚏实验阳性率,检验模型建立的成功与否。2.在无菌条件下取出大鼠胫骨和股骨,采用贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs);在无菌条件下取足月健康胎儿脐带标本,用双酶法分离、纯化脐带间充质干细胞(UCMSCs)。两种MSCs均用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基培养。3.用流式细胞仪检测细胞表面标志,对培养的细胞进行鉴定;通过细胞形态学观察,MTT法检测细胞增值能力、描绘生长曲线,观察体外培养的MSCs的生物学特性。4.以脂质体2000为载体,用pEGFP-N1对两种MSCs进行标记,将获得的标记细胞分别注射于两组SUI模型大鼠尿道周围,常规饲养两周后用BL-410生物机能实验系统检测尿流动力学指标,并检测喷嚏实验阳性率。5.处死大鼠,进行尿道及其周围组织、膀胱取材,通过HE、Masson染色观察尿道及其周围组织和膀胱的病理形态学变化;在荧光显微镜下观察实验组标本切片有无绿色荧光,检验移植的间充质干细胞是否在体内成功生长增值。结果:1.建立SUI模型:模拟人类妊娠、难产产伤、去势后低雌激素能成功获得稳定的动物模型。实验组大鼠与阴性对照组、阳性对照组大鼠的最大膀胱容量分别为(1.93±0.49)ml、(3.21±0.58)ml、(3.14±0.52)ml;漏尿点压力值分别为(23.83±4.23)mmHg、(30.57±3.31)mmHg、(30.28±1.99)mmHg。这两个尿流动力学指标实验组均明显低于两对照组(p＜0.05),而两对照组之间无统计学差别(p＞0.05);喷嚏实验阳性率实验组(72.2%)明显高于两对照组(均为0)。2.体外培养MSCs和MSCs的生物学特性:原代BMSCs接种24h后部分贴壁,呈圆形,72h后绝大部分细胞贴壁,形态为梭形,呈集落样生长。10～12天后细胞近融合,可进行首次传代。传代后细胞增殖速度加快,传3～4代后细胞形态均一。培养的第3代细胞97.68%表达CD29,2.76%表达CD45,证实为间充质干细胞。原代培养的UCMSCs多于接种24～48h内贴壁,14～16天左右细胞80%融合,细胞梭形,呈平行排列样生长或漩涡样生长,传代后细胞增殖速度加快,传2～3代后细胞形态均一。培养的第3代细胞99%以上表达CD29、CD44,而CD34、CD45、CD31呈阴性,证实为间充质干细胞。两种MSCs大部分处于静止期及DNA合成前期(G0～G1期),少数处于有丝分裂期和DNA合成期。绿色荧光蛋白pEGFP-N1的标记率分别为(15.18±2.57)%和(15.68±1.03)%。3.SUI模型尿道周围MSCs移植:实验分3组:BMSCs注射组、UCMSCs注射组和PS注射组。(1)BMSCs移植组大鼠与UCMSCs移植组大鼠的最大膀胱容量(3.06±0.77&3.22±0.77)ml和漏尿点压力值(28.60±3.98&30.62±2.76)mmHg均明显高于治疗前(p＜0.05),并与阴性和阳性对照组无统计学差别(p＞0.05),而PS注射组治疗前后尿流动力学指标无统计学差别(p＞0.05);PS注射组最大膀胱容量和漏尿点压力均小于BMSCs注射组和UCMSCs注射组(p＜0.05),而两细胞移植组间的比较无统计学差别(p＞0.05)。两细胞移植组喷嚏实验阳性率(16.7%)明显低于PS注射组(83.3%)。4.尿道及其周围组织行HE、Masson染色后光镜形态学观察:PS注射组与阴性和阳性对照组比较,括约肌排列松散,部分肌肉有断裂现象,肌层变薄;筋膜间结缔组织所占比重增加,胶原纤维稀疏,排列紊乱;阴道粘膜上皮层萎缩。两细胞移植组大鼠尿道壁肌层较PS注射组增厚,但与对照组比较排列仍相对紊乱和松散;肌层和筋膜间结缔组织变紧密;阴道上皮萎缩未见明显改善。各组膀胱组织的光镜形态学无明显差别,平滑肌束清晰完整、连续,粘膜复层上皮未见明显异常。5.尿道及其周围组织切片后荧光显微镜下观察:移植2周后,两移植组可见到绿色荧光,而其余各对照组均未见到荧光的表达,证实移植细胞在大鼠体内存活,增殖情况良好。结论:1.依据SUI的发病机理为建模思路,根据尿流动力学指标、喷嚏实验阳性率的差异性可建立稳定的动物模型。2.应用贴壁法和双酶法可分别获得较纯的大鼠骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞。纯化的BMSCs不表达CD45,表达CD29;纯化的UCMSCs不表达CD34、CD45、CD31,表达CD29、CD44。两种MSCs的细胞周期主要是G0-G1期,并且在体外具有良好的扩增能力。原代培养的MSCs性状稳定,表型稳定均一,可用于进一步的组织工程研究。pEGFP-N1质粒可作为间充质干细胞的标记物,脂质体介导的质粒转染法适用于细胞的短期标记。3.PS注射组大鼠尿道括约肌和周围组织的不完整性,提示盆底组织结构破坏和生化改变是SUI的发生原因之一。SUI去势大鼠模型(PS注射组)的低雌激素和雌激素受体状态造成阴道上皮层萎缩是SUI发生的因素之一。4.大鼠骨髓间充质干细胞和人脐带间充质干细胞可以在损伤的大鼠尿道周围组织中存活、增殖,改善尿流动力学指标和喷嚏实验的阳性率;形态学上观察可修复尿道周围的支持结构,但未能改善大鼠体内的低雌激素水平状态。