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肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达,主要存在于骨骼肌中,其家族成员庞大,依据其来源可分为经典的肌球蛋白和非经典的肌球蛋白。肌球蛋白分子外形如芽菜状,由多条重链与多条轻链构成。肌球蛋白Ⅱ是目前研究中最为广泛的一类蛋白。家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链(Bombyx mori MyosinⅡessential light chain,BmMyosinⅡELC)的功能研究较少。家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链基因全长为1086bp,开放阅读框为444 bp,编码的蛋白大小为16 kDa。家蚕肌球蛋白Ⅱ的的研究甚少,但在其他物种中,尤其是哺乳动物中,肌球蛋白磷酸化后在细胞迁移,细胞收缩,以及调控细胞的形态与凋亡等方面有着至关重要的作用。本研究中主要从生物信息学预测,选择性压力分析,家蚕肌球蛋白对细胞迁移方面的影响,转录时相,表达时相以及蛋白互作等方面展开,为后续继续研究家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链提供了基础,具体研究结果如下: (1)生物信息学预测分析表明,家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链开放阅读框为444bp,蛋白大小为16 kDa,等电点为4.49。根据NCBI数据库中提取出的28条相似序列中,经比对后发现都包含有EFh结构域,此位点中包含着Ca2+的结合区域。通过NJ进化树分析发现,家蚕肌球蛋白与帕眼蝶肌球蛋白相似性最高。亚细胞定位预测结果表明,家蚕肌球蛋白主要在细胞质中分布,而且没有检测到跨膜区域的存在。选择性压力分析表明,28条序列在进化过程中都未发现存在有正向选择位点,Ka/Ks值全部小于1,说明肌球蛋白在进化过程中较为保守。 (2)利用原核表达系统对家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链基因进行克隆,并对家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链蛋白大量诱导表达,分离纯化后免疫小鼠,得到家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链的多克隆抗体,经过验证多克隆抗体的特异性与效价后基本可以满足后续实验的要求。 (3)为了探究家蚕肌球蛋白与哺乳动物肌球蛋白功能特性的区别,我们构建了不同的载体转染相应的细胞系。细胞创伤实验结果表明,家蚕肌球蛋白与哺乳动物肌球蛋白功能相类似,同样可以促进细胞迁移。 (4)不同品系家蚕(306,NB,BC8)在受到家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nueleopolyhedrovirus,BmNPV)的影响后,转录时相分析表明,易感BmNPV306品系中家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链基因在12h与其他时间点相比转录水平明显增高。三种品系相比,抗性品系转录水平明显高于易感型品系;从表达水平来看,出现了相反的结果,抗性品系家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链表达反而低于易感型家蚕,其原因并不清楚。 (5)体外蛋白互作pull-down实验表明,家蚕肌球蛋白Ⅱ必需轻链可以与BmNPV的泛素发生相互作用。