柞蚕丝蛋白的矿化性能及结构表征

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蚕丝是一种具有几百年手术缝合线历史的天然高分子,它由丝胶包围两条丝素纤维而成,丝胶占蚕丝总重的20~30%。丝胶是一类水溶性的天然蛋白质,它的分子量为20~310kDa,具有抗氧化性、抗菌性、抗紫外性、吸湿性、生物降解性等特点。丝素纤维大分子是由结晶区和无定形区组成的,其中结晶区占2/3左右。丝素结晶区中大量的-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-重复序列形成了β-片层结构,使得蚕丝纤维具有较好的机械性能;丝素还具有较好的生物相容性和生物降解性。因此,蚕丝蛋白(丝胶和丝素)有望用作生物材料基质。生物矿化是一种广泛存在的天然现象,比如骨和牙齿的形成,它们是由纳米羟基磷灰石晶体沉积在胶原纤维有机基质上形成的、具有特定排列结构的矿化生物复合材料。近年来,利用骨组织工程作为临床整形的再生策略得到越来越多的重视。羟基磷灰石(HAp, Ca10(P04)6(OH)2)独特的生物相容性和生物活性,及其在生物体内特定的结构与功能,使得它备受人类的关注。丝胶可用作羟基磷灰石微球的制备模板,且羟基磷灰石沉积与丝胶蛋白的结构密切相关。当丝胶具有较高分子量和β-片层结构时,能更有效地诱导羟基磷灰石的沉积。与丝胶类似,丝素也可有效诱导羟基磷灰石晶体的形成,可用作羟基磷灰石的制备模板。中国柞蚕是野蚕的一种,主要产于中国东北部。与家蚕丝胶相比,柞蚕丝胶具有较少的丝氨酸和酪氨酸,但至今与之相关的功能研究报道还很少。通过对柞蚕丝胶矿化性能的研究,有利于促进其在骨组织工程领域内的应用。与家蚕丝素相比,柞蚕丝素中Ala,Asp和Arg含量较高,而甘氨酸(Gly)则较低。柞蚕丝素中大量的碱性氨基酸和Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列,与细胞有特定的作用,有利于促进细胞的生长,有望用作生物材料制备原料。通过探索低成本、绿色环保的柞蚕丝素溶解方法,有利于促进柞蚕丝素在创伤修复、人工皮肤、细胞培养支架、药物载体等非织物领域内的应用。本文主要进行了以下三个内容的研究。首先,本研究采用钙溶液和磷酸盐溶液交替浸渍法对柞蚕丝胶的矿化性能进行了研究。柞蚕丝胶对碳酸钙沉淀的抑制实验及von Kossa染色法实验结果表明,柞蚕丝胶具有Ca离子结合活性。扫描电镜和XRD光谱分析显示,柞蚕丝胶膜表面可矿化形成球状羟基磷灰石晶体。通过细胞相容性实验,发现柞蚕丝胶适合MG-63细胞的生长,说明它具有很好的生物相容性。其次,本研究采用钙溶液和磷酸盐溶液交替浸渍法对柞蚕丝素的矿化性能进行了研究。Von Kossa染色结果表明,与柞蚕丝胶类似,柞蚕丝素也具有Ca离子结合活性。通过扫描电镜、FTIR、X-射线等测试,发现柞蚕丝素膜经钙溶液和磷酸盐溶液交替浸渍处理后,表面可矿化形成羟基磷灰石晶体。MG-63细胞培养实验结果显示,矿化柞蚕丝素膜可提高MG-63细胞生长活性,具有很好的细胞相容性。最后,为了解决柞蚕丝素纤维在普通溶剂中难以溶解的问题,本着降低生产成本和提高环保性能的宗旨,本研究探索了两种尿素溶剂(8mol/L Urea/NaOH、8mol/L Urea/LiOH)用于常温下溶解柞蚕丝素纤维、制备再生柞蚕丝素粉末,促进柞蚕丝素在生物医用材料领域内的应用。Urea/NaOH溶剂体系溶解的是非结晶区柞蚕丝素蛋白,而Urea/LiOH溶剂体系溶解的是结晶区和非结晶区柞蚕丝素蛋白。两种溶剂体系获得的柞蚕丝素粉末具有不同的结构特征和氨基酸组成比例,因此,生产上可根据再生柞蚕丝素的用途,选择合适的尿素溶剂溶解柞蚕丝素纤维。
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