第一部分缺血性脑卒中相关差异miRNA和靶基因的筛选目的:本研究通过生物信息学方法对已发表缺血性脑卒中相关的mRNA和miRNA高通量数据进行整合分析,运用多种工具、算法分析和预测靶向miRNA-mRNA关系,然后用Cytoscape软件构建由miRNAs和mRNAs组成的生物信息调控网络,预测miRNA参与调控缺血性脑卒中的关键分子通路。方法:首先从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索并下载源自缺血性脑卒中患者、利用二代测序技术获得的mRNA和miRNA表达数据,利用R软件进行分析,将miRNA表达数据进行总体归一化处理,分析其中的差异表达miRNA,基因本体数据库(Gene ontology,GO)分析分子功能、生物学过程和细胞组通过KEGG数据库,分析基因组序列、功能以及通路信息。采用miRNA靶基因预测工具数据库筛选差异表达的miRNA的靶基因。结果:通过对纳入的卒中患者相关的miRNA和mRNA原始数据进行分析,筛选差异表达的miRNA及mRNA。共筛选获得15个差异表达miRNA,其中显著下调的有10个,显著上调的有5个。共筛选得到差异表达基因1178个,其中显著下调的有550个,显著上调的有628个。用Cytoscape软件我们筛选的靶基因构成的网络图共有971个关系。结论:本部分初步筛选以上miRNA和关键靶基因与缺血性脑卒中患者的转移有关,为缺血性脑卒中发病的机理研究提供了一些候选靶点,后续将进一步实验确证分析结果,并在体外培养的缺血性脑卒中动物模型中深入研究其调控作用机理。为了更好的研究差异表达靶基因的功能,我们分别对11178个差异表达的基因分别进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,共1026个基因显著富集到GO功能和KEGG通路,其中前15个显著富集的GO功能和KEGG通路。第二部分缺血性脑卒中候选miRNA的验证目的:我们应用荧光实时定量PCR方法对收集的缺血性脑卒中样本进行检测分析,以验证miRNA与靶基因的表达及靶向关系,从而对缺血性脑卒中的发病机理进行探究,寻找新的分子标志物和潜在的诊断或治疗靶标。方法:我们募集了80名患者(年龄65.1±8.4岁),神经病学门诊部,并被诊断为缺血性脑卒中患者。对所有入选的研究对象进行一般情况采集,包括出生年月、性别和病史采集,其中病史采集包括高血压病、糖尿病等。测定生化指标。提取患者RNA提取,采用qRT-PCR方法检测基因的表达。结果:纳入分析的缺血性脑卒中患者和对照组都是80例,与正常组相比,脑卒中患者并发高血压、糖尿病的患者明显增高;抽烟和酒精的比例也高于对照组;生化指标SBP、DBP、血糖、TG、HDL、LDL指标明显比对照组健康程度差(P<0.05)。对筛选获得的差异表达miRNA和5个连接度最大的关键靶基因,采用qRT-PCR实验对采集的缺血性脑卒中血液中的部分miRNA和关键靶基因在的表达进行检测。结果显示,与正常组相比,缺血性脑卒中患者中的NOTCH1、PIP4K2B和DIP2B表达上调,而IGFBP5和hsa-miR-424表达下调。结论:本部分研究初步表明,以上miRNA和关键靶基因与缺血性脑卒中的发生相关,这为缺血性脑卒中发病的机理研究提供了一些候选靶点。第三部分miR-424参与缺血性脑卒中发展的分子机制研究目的:研究治疗缺血性脑卒中的药物的新靶点具有重要意义。在本研究中,我们探讨了miR-424在氧葡萄糖剥夺(OGD)中的神经保护作用,在PC-12细胞中引起的伤害。方法:PC-12细胞接受了OGD刺激来模拟缺血性损伤。通过与miR-424模拟、miR-424抑制剂、pEX-MKP-1或sh-MKP-1的短暂转染改变了miR-424和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表达方式。细胞计数基-8(CCK-8)试验、流式细胞学、定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分别检测细胞存活能力、凋亡细胞和miR-424和MKP-1的表达。蛋白质表达的几个因素是由蛋白质印迹决定的。同时,对相关的荧光素酶活性测定进行了验证,以验证预测的目标关联。结果:OGD通过抑制细胞存活和诱导细胞凋亡,导致了PC-12细胞的损伤。通过增加细胞生存能力和减少细胞凋亡,对miR-424细胞的过度表达保护了PC-12细胞。MKP-1是miR-424的直接目标,它的表达式受到miR-424的负调控。通过抑制缺氧诱导因子1α((HIF-1α)的表达,从而抑制了PI3K/AKT/mTOR途径,加强了对MKP-1的表达,从而加剧了OGD诱导细胞损伤。结论:miR-424通过对MKP-1表达的直接抑制,保护PC-12细胞免受OGD诱导损伤,因为MKP-1通过抑制HIF-1α和PI3K/AKT/mTOR途径的表达,促进了OGD诱导的细胞损伤。