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细胞凋亡是一种正常的细胞程序性死亡,哺乳动物中Caspase家族在线粒体凋亡通路中起着重要的作用,Caspase家族分为两大类:起始Caspase和执行Caspase。通常,起始Caspase的活化导致Caspase级联,因此,起始Caspase在细胞凋亡通路中具有重要的作用。哺乳动物中已鉴定多种起始Caspase,其中Caspase-9是研究较为深入的起始Caspase。昆虫中Caspase-9同源基因也已鉴定,鱗翅目中的家蚕、舞毒夜蛾以及草地贪夜蛾均已克隆和鉴定出Caspase-9同源的起始Caspase。我们实验室多年从事斜纹夜蛾(SpodopteraLitura)细胞凋亡研究,为深入研究斜纹夜蛾细胞凋亡信号转导途径,我们克隆了斜纹夜蛾Caspase-9同源物Sl-caspase-5基因,原核表达Sl-caspase-5蛋白,制备了相应抗体,初步研究了Sl-caspase-功能,主要研究成果如下:1、Sl-caspase-5基因的克隆,氨基酸序列比对分析及其蛋白功能预测(1)成功克隆的Sl-caspase-5基因全长1587bp,最大的开放阅读框为1338bp。编码445个氨基酸,预测的Sl-caspase-5蛋白质的等电点为6.40,相对分子质量约为51.136Da。(2)Sl-casase-5氨基酸与其他鳞翅目昆虫的起始Caspase如家蚕(Bombyx mori)Bm-dronc,棉铃虫(Helicoverpa armfgera)Ha-caspase-5,草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf-dronc,舞毒蛾(Lymantria dispar)Ld-caspase-5,果蝇(Drosophila melanogaster)Dm-dronc 等氨基酸的同源一致性分别是 54%,70%,88%,58%和 28%。预测Sl-caspase-5的蛋白三级结构有14个α螺旋,5个p折叠和一些无规卷曲。Sl-caspase-5蛋白在310位半胱氨酸(C)的周围具有保守的五肽序列(QMCRG),N端有募集结构域Card区以及靠近C端的大、小亚基P20和P10构成的活性结构域,结构分析显示Sl-caspose-5属于起始Caspase。2、Sl-caspase-5的原核表达与纯化构建了Sl-caspase-重组原核表达载体pET-28-Sl-caspase-5-His6,转化感受态细胞BL-21,IPTG诱导表达,先后采用镍柱纯化和分子筛纯化系统纯化Sl-caspase-5蛋白,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测表明原核表达的Sl-caspase-5蛋白发生了自我剪切。为了阻止Sl-caspase-5的自我剪切,我们将Sl-caspase-5第310位的活性氨基酸半胱氨酸突变成丙氨酸即Sl-caspose-5-C310A,构建原核表达载体pET-28-Sl-caspase-5-C310A-His6,表达纯化获得 Sl-caspase-5 完整的蛋白,以此蛋白作为抗原免疫家兔制备出多克隆抗体。3、Sl-caspase-5具有起始Caspase酶活性Sl-caspase-5的大量原核表达中能够自我剪切并活化,为测定其是否具有酶活性特异性,用Ac-IEVD-AFC作为荧光底物,测定了 Sl-cospose-5活性,结果显示它能催化底物分解,焚光光度分析表明Sl-caspfase-5蛋白有较高Caspase酶活性。4、Sl-cospfase-5蛋白的功能分析(1)Sl-caspase-5与Apaf-1、效应caspase在离体条件下的相互作用原核表达有活性的Sl-caspase-5蛋白与效应Caspase Sl-caspase-1在一定反应缓冲体系下可以发生相互作用,Sl-caspase-1被Sl-cospose-5蛋白切割成相对分子质量约为19 KD和12KD两个亚单位。低温短时间诱导表达无活性的Sl-cospase-5酶原蛋白,在dATP、Apaf-1和Sl-caspase-1 存在条件下,Apaf-1 能够激活Sl-caspase-酶原,将 Sl-caspase-1 切割两个亚单位,此结果与单独的有活性的Sl-caspase-5与Sl-caspase-1相互作用结果一致。在上述体系中另外加入含有Card募集结构域的截短Sl-caspase-5-Card蛋白,Sl-caspase-1又不被切割,提示截短Sl-caspase-5-Card蛋白竞争性与Apaf-1作用,抑制了Sl-caspase-活性,说明 Sl-caspase-5 活化需要 Apaf-1。(2)Sl-caase-5过表达诱导细胞凋亡将带有绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIE2-N1-Sl-caspase-5-GFP、PIE2-N1-Sl-cassPase-5-C310A-GFP 和 pIE2-GFP-N1 转染至 S1-1 细胞,36 小时后荧光显微镜下观察显示,Sl-caspase-5的过表达导致产生凋亡小体,诱导了细胞凋亡;而过表达Sl-caspase-5-C310A突变蛋白的细胞中没有观察到凋亡小体,但细胞内有绿色荧光蛋白的聚集现象,这是由于Sl-cfaspase-5-C310A能够被Apaf-1募集,但不能被活化,从而不能引起下游的级联反应。(3)Sl-caspase-5过表达促进放线菌素D诱导的细胞凋亡在低浓度的放线菌素D 诱导下,S1-1细胞转染pIE22-Sl-caspase-5-Flag-N 1,pIE2-Sl-caspase-5-Card-Flag-N 1,plE2-Sl-caspase-5-C310A-F lag-N1和pIE2-Flag-Nl真核表达质粒。Western印迹分析显示,Sf-caspase-1抗体进行杂交,只有Sl-caspase-5的过表达才出现Sl-caspase-1被切割的现象。流式细胞术分析表明,在低浓度放线菌素D诱导下Sl-caspase-5过表达细胞的凋亡率为40.05%,转染空载的质粒的凋亡率为20.09%,而过表达Sl-case-5-Card的凋亡率是13.48%,说明Sl-caspase-5过表达具有促进放线菌素D诱导细胞凋亡作用。斜纹夜蛾起始Caspase Sl-caspase-5的克隆、鉴定以及功能分析,为进一步研究Sl-caspase-5、细胞色素C和Apaf-1的关系,凋亡体形成与功能,解析细胞色素C介导的线粒体途径等奠定了基础。