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食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国尤以河北、河南、粤东沿海等地区高发,具有发病率高、治愈率差和死亡率高等特点。目前食管癌的主要治疗方法有手术、化疗和放疗等,虽然近年来随着诊疗技术的提高和治疗方法的不断改进,食管癌病人的生存率及功能恢复率大为提高,但是疗效仍不尽人意。因此对食管癌的发生机制、诊断和防治研究仍是当前肿瘤学科的热点课题。肿瘤是一种基因病,是长期的、多步骤、多阶段、多种基因突变积累的结果。肿瘤恶性生物学行为包括细胞增殖和凋亡失衡、新生血管的形成及肿瘤细胞的侵袭和转移等。另外肿瘤细胞的无限制增殖能力和演进能力与干细胞的自我更新能力和多能性分化极其类似,这些特点提示肿瘤细胞中可能会存在某些类似胚胎干细胞调控自我更新的关键基因的异常表达,从而引起单克隆肿瘤细胞的无限制增殖。干细胞自我更新能力和多能性分化能力的维持是以Nanog、OCT-4和SOX2等转录因子和PI3K、Wnt和STAT3等信号通路为主构成的复杂网络来调控的。Nanog是调控、维持调控干细胞自我更新能力网络中的主要成员,也是与OCT-4平行的另一条重要的分子调控途径。近年来的研究发现Nanog基因不仅参与胚胎发育过程自我更新能力的调节,而且在胚胎性癌、精原细胞瘤等恶性生殖细胞肿瘤中也异常表达,随着研究的发展人们在肺癌、胃癌等一些实体瘤内也检测到了Nanog的异常表达且与肿瘤的发生发展密切相关。然而有关Nanog在食管癌中的表达及其与食管癌关系的研究,迄今国内外未鲜见文献报道。为探讨Nanog在食管鳞癌组织中的表达情况及其与食管癌临床病理因索之间的关系,评价Nanog和MDR1之间的关系并分析Nanog的表达水平对人食管癌细胞生物学行为的影响。本研究检测了食管癌组织、癌旁正常组织中Nanog的表达情况,探讨了Nanog与食管癌恶性生物学行为的关系。并构建了携带Nanog mRNA编码区全长cDNA序列和siRNA序列的真核表达载体来研究Nanog对食管癌9706细胞增殖、克隆、侵袭及药物敏感性等恶性生物学行为的影响；通过裸鼠移植瘤实验进行体内试验,从多个方面深入探讨Nanog对食管癌9706细胞的影响,试图阐明Nanog的表达在食管癌发生、发展中的意义。为使Nanog早日应用于食管癌临床诊断和治疗提供一定的理论依据。本实验研究共分以下4章。第一章：Nanog在食管癌组织中的表达及意义方法采用免疫组织化学、Real-time PCRf和Western的方法检测79例食管癌组织和23例癌旁正常组织组织之中Nanog和MDR1的表达情况。结果食管癌组织Nanog和MDR1阳性表达高于癌旁正常组织,两种食管组织表达差异有统计学意义(P<0.05); Nanog阳性表达率与食管癌患者病理分级和淋巴结转移有关(P<0.05); MDR1阳性表达率与食管癌患者病理分级和淋巴结转移有关(P<0.05),且食管癌组织中Nanog和MDR1的表达相互之间呈明显的正相关(P<0.05)。第二章：Nanog对食管癌9706细胞生物学行为的影响及机制研究方法1.构建携带人Nanog mRNA编码区全长cDNA序列和特异性siRNA序列的真核表达质粒载体,转染并筛选出阳性稳定转染细胞克隆。2.采用MTT和平板克隆法测定Nanog对9706细胞增殖和克隆能力。3.采用流式细胞术(FCM)测定Nanog对9706细胞周期和凋亡的情况。4.采用侵袭小室和凝胶没谱实验检测Nanog对9706细胞侵袭能力和明胶酶活性的影响。结果1. pcDNA3.1-Nanog和pSUPER-EGFP-Nanog真核表达载体构建及转染9706细胞成功。2.MTT和平板克隆实验结果显示：与对照组相比,pcDNA3.I和pSUPER-EGFP组细胞增殖和克隆能力无明显差异(P>0.05),pcDNA3.1-Nanog-3组细胞增殖和克隆能力明显增强(P<0.01),而pSUPER-EGFP-Nanog-b组细胞增殖和克隆能力明显减弱(P<0.01)。3.FCM结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组各周期细胞比例无明显差异(P>0.05); pcDNA3.1-Nanog-3组Go/G1期细胞比例明显减少(P<0.01),S和G2/M期细胞比例升高(P<0.05), pSUPER-EGFP-Nanog-b组Go/G1期细胞比例明显升高(P<0.01),S和G2/M期细胞比例减少(P<0.05),同时与各组相比其凋亡率增加。4.侵袭小室和凝胶酶谱实验：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP组侵袭能力和明胶酶活性无明显差异(P>0.05), pcDNA3.1-Nanog-3组细胞侵袭能力和明胶酶活性升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b组降低(P<0.01)。第三章：Nanog对食管癌9706细胞药物敏感性的影响及机制研究方法1.采用MTT方法检测顺铂对人食管癌各组9706细胞增殖的影响并计算抑制率。2.采用FCM检测顺铂对人食管癌各组9706细胞周期和凋亡率的影响。3.采用Real-time PCR和Western方法检测Nanog对970细胞MDRlmRNA和蛋白表达水平的影响结果：1.MTT结果显示：Nanog可以对抗顺铂诱导的9706细胞的增殖抑制作用,减弱顺铂药物毒性(P<0.01)。2.FCM结果显示：Nanog可以对抗顺铂诱导的9706细胞细胞G0/G1期周期阻滞和凋亡作用(P<0.01)。3. Real-time PCR和Western blot结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP组细胞MDR1表达水平无明显差异(P>0.05), pcDNA3.1-Nanog-3组升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b组降低(P<0.01)。第四章：Nanog对食管癌9706细胞裸鼠移植瘤影响的研究方法1.建立人食管癌裸鼠移植瘤模型。分为对照组、pcDNA3.1-Nanog-3组和pSUPER-EGFP-Nanog-b组。每周测量瘤体大小并绘制肿瘤体积生长曲线。治疗终止时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑廇率。2.采用TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数(AI)。3.采用Real-time PCR和Western方法检测各组裸鼠移植瘤组织中Nanog和MDR1表达情况。结果1. pcDNA3.1-Nanog-3组裸鼠移植瘤体积和重量显著大于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05); pSUPER-EGFP-Nanog-b组裸鼠移植瘤体积和重量显著小于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2. TUNEL结果显示pSUPER-EGFP-Nanog-b组裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡指数明显多于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。3. pcDNA3.1-Nanog-3组裸鼠移植瘤Nanog和MDR1 mRNA和蛋白表达显著高于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01); pSUPER-EGFP-Nanog-b组显著低于对照组,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1. Nanog在食管癌组织中高表达,与食管癌的病理分级和淋巴结转移密切相关,与MDR1的表达相互之间呈明显的正相关。2. Nanog促进食管癌9706细胞的增殖、克隆和侵袭及耐药能力,当抑制其表达时会导致细胞增殖、克隆和侵袭及耐药能力的减弱,阻滞细胞于G0/G1期,诱导凋亡；其机制与调控MPP-2和MPP-9分泌及MDR1表达密切相关。3.裸鼠移植瘤模型体内试验与体外实验结果相似,Nanog可以促进移植瘤的增殖并调控MDR1的表达来参与肿瘤的发生、发展。