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目的：1.构建WFDC2基因稳定低表达的人浆液性卵巢癌细胞株SKOV3,体外检测WFDC2基因沉默对肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。2.构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤生长、转移特点的变化。3.从表皮生长因子受体(epidermal growch factor receptor,EGFR)等信号通路研究低表达WFDC2显著抑制SKOV3生长的机制。4.立足乳清酸蛋白(WAP)家族具有抑制环的结构上的共性和调节蛋白酶活性的功能上的共性,探讨1)WFDC2基因编码的人附睾蛋白4(HE4)是否能和MMP-9(基质金属蛋白酶-9)和MMP-2结合；2)HE4蛋白对已经激活的的MMPs酶活性是否存在调节作用,在蛋白水平探讨HE4蛋白与基质金属蛋白酶相互作用对卵巢癌侵袭能力影响的机制。5.立足卵巢癌疾病的“异质性”,应用卵巢浆液性癌“两级分级系统”(two-tier system),对比HE4蛋白在低级别浆液性癌(low-grade serous carcinoma,LGSC)和高级别浆液性癌(high-grade serous carcinoma,HGSC)组织和血清中的差异,为进一步研究WFDC2基因和HE4蛋白的功能提供新思路。方法：1.以慢病毒pLKO.1为载体,构建人WFDC2基因特异的小干扰序列shRNA,筛选有效的序列,通过酶切、连接、转化和筛选,获得WFDC2基因沉默的慢病毒载体后转染SKOV3,经RT-PCR和Western-blot鉴定。嘌呤霉素压力筛选获取WFDC2基因稳定低表达的细胞株后,分为4组进行体外实验,即两株WFDC2基因稳定低表达的细胞株(OEC-si5和OEC-si8)、空载体细胞株(OEC-mock)和未处理的细胞株(OEC),MTT检测细胞增殖、Annexin/PI法流式细胞仪检测细胞凋亡、Transwell法检测细胞侵袭、迁移,Westernblot法检测EGFR)通路中相关蛋白的变化和MMP-9、MMP-2的改变。2.选择5号稳定株进行体内实验,分3组：未处理组(OEC)、转入空载体组(OEC-mock)和转染shRNA组(OEC-si5),组织块移植法建立二代卵巢癌荷瘤裸鼠模型。观察各组肿瘤生长、转移特点的变化,免疫组化检测HE4蛋白,细胞核增殖抗原(PCNA)、微淋巴管密度的改变。3.Westernblot检测体外实验细胞中PI-3K-Akt-STAT3通路中Akt、p-Akt、 STAT3、p-STAT3和ERK-JNK-Jun-Fos通路中相关蛋白ERK、pERK、JNK、 c-Jun、c-Fos表达量的变化,探讨影响增殖和侵袭的机制。4.通过免疫共沉淀研究HE4蛋白和基质金属蛋白酶MMP-9、MMP-2是否有结合；激活SKOV3培养上清中的MMP-2和MMP-9后,再和MMPs的特异性底物共同孵育,明胶酶谱法和底物裂解法研究HE4蛋白对MMP9、MMP2酶活性的影响。5.以两级分级系统将60例浆液性卵巢癌分为低级别LGSC和高级别HGSC亚型,ELISA检测血清中HE4蛋白和同位素法检测血清CA125的水平,免疫组化检测HE4蛋白在卵巢癌组织中的表达水平,对比HGSC和LGSC血清、组织中HE4蛋白表达的差异。结果：1.体外实验。1)基因测序表明寡核苷酸成功插入到预计位点。慢病毒感染SKOV3细胞后与对照组比较,HE4的mRNA和蛋白表达量明显降低,提示成功构建了的特异性抑制人WFDC2基因的真核表达载体,并经抗生素压力筛选形成稳定株;2)增殖：敲低WFDC2基因后,SKOV3细胞株增殖显著减慢、PCNA表达量显著降低；细胞周期出现G0/G1期阻滞、cyclinD1蛋白表达量显著降低；3)凋亡：转染5号shRNA的细胞株(OEC-si5)的早期细胞凋亡率升高(P<0.05),晚期凋亡和坏死率无差异。凋亡基因Bax、Bcl-2、Casp3、TP53、Fas/FasL和凋亡蛋白bax、bcl-2和Caspase-3无显著变化。4)侵袭和迁移：Transwell侵袭和迁移细胞数显著下降(P<0.05)；5)信号通路：ERK-JNK-Jun-Fos通路中相关蛋白pERK、JNK、c-Jun、c-Fos的表达量均显著下降,基质金属蛋白酶MMP-9表达量下降。2.动物实验。1)生长曲线。转染shRNA组(OEC-si组)自移植3天后,与空白对照组(未处理组OEC、转入慢病毒空载体组OEC-mock)开始出现差异(P<0.01),而OEC和OEC-mock之间肿瘤体积一直无差异(P>0.05)；2)OEC-si组皮下移植瘤的生长速度显著慢于空白对照组(P<0.05)；3)OEC-si组首次出现可见肿瘤的时间晚于空白对照组(P<0.05);4)实验终点时肿瘤重量：OEC-si组肿瘤重量低于空白对照组。5)OEC-si组织的HE4、PCNA表达量、微淋巴管密度均低于空白对照组。6)实验组和对照组均未发现淋巴结转移。3.体外细胞实验WFDC2基因沉默抑制细胞生长的机制。WFDC2基因后,Akt、p-Akt、STAT3和p-STAT3表达量无变化；总ERK无变化,磷酸化ERK表达量降低伴随着JNK2、p-c-Jun和c-Fos表达量的降低。4.HE4蛋白与基质金属蛋白酶。免疫共沉淀显示HE4和MMP-9、MMP-2有结合；HE4显著抑制SKOV3细胞培养液上清中MMP-9和MMP-2的活性,以MMP-9最明显；抑制率与HE4的浓度呈正相关。5.临床研究。高级别浆液性癌(HGSC)组织中HE4蛋白阳性率显著高于低级别浆液性癌(LGSC)(P<0.01); HGSC的血清中HE4蛋白的水平高于LGSC(P<0.01)；早期FIGO(Ⅰ+Ⅱ期)病例中,HGSC和LGSC组织中HE4蛋白表达量有差异(P<0.05),但血清中HE4蛋白的水平无差异(P>0.05)。结论：1. WFDC2基因参与促进SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭等行为。ERK-JNK-Jun-Fos信号通路参与了该过程；不能确定WFDC2基因与凋亡的关系。WFDC2基因可能在人卵巢浆液性上皮癌进展中起重要作用,2. WFDC2基因沉默显著抑制人卵巢癌SKOV3细胞株在裸鼠体内的生长。3.HE4蛋白可以和MMP-9、MMP-2结合,对激活的的MMP-9的酶活性存在明显的抑制作用,该作用和HE4的浓度呈正相关；4.HE4在鉴别低、高级别浆液性癌有潜在意义,但不能肯定血清HE4对高级别浆液性癌的早期诊断的价值,需要慎重对待目前文献过于肯定HE4早期诊断价值的结论。