随着国际原油价格持续攀升、主要产油地区政治的动荡及资源的日渐趋紧，人们将替代传统能源的希望寄托于可再生能源。乙醇是一种重要的可再生液体燃料。目前我国乙醇发酵的主要原料是粮食。燃料乙醇的发展在一定程度上缓解了能源紧缺，却引发了粮食安全问题。木质纤维素是地球上最丰富的生物质资源，利用生物质来生产乙醇，将能避免能源与粮食的矛盾，但目前还存在一系列技术问题。在降解木质纤维素等生物质为可发酵性糖的过程中，会产生许多抑制物如乙酸、糠醛等，严重影响了乙醇发酵。另外，在乙醇生产过程中，发酵微生物也会遇到各种各样的环境压力及自身代谢产物的影响，如高温、高渗透压、高浓度乙醇等。因此，一个具强抗逆性的生产菌株是乙醇生产的一个先决条件。　　 微生物适应各种压力的机理是复杂的，目前尚有许多未知之处，而且涉及的基因众多，因此难以利用理性的代谢工程提高菌株的抗逆性，特别是对于一些遗传背景不很清楚的微生物。进化工程是追随自然进化的原理来改良菌种的，通过重复变异、重组及筛选来提高微生物性状，适用于菌株复杂性状的改良。本研究应用进化工程来提高产乙醇酵母的抗逆性和乙醇发酵能力。　　 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)是目前乙醇发酵的主要生产菌。为了提高酿酒酵母对多种环境压力的耐受性，一株乙醇高产菌株Saccharomycescerevisiae SC521经过9轮冻融和多轮筛选，分离到一株多压力耐受性更高的突变株FT9-11。FT9-11对热击、乙醇、H2O2及冻融压力的耐受性比SC521分别提高了23、25.6、10.3和7倍，同时也提高了对乙酸和渗透压的耐受性，FT9-11延迟了发酵诱导的热耐受性的下降。冻融处理也提高了菌株的乙醇发酵性能。当发酵温度为30℃、发酵培养基中葡萄糖初始浓度为200 g-l时，FT9-11的乙醇发酵情况与SC521相似，而当葡萄糖初始浓度提高到300或40091-1时，FT9-11的乙醇产量分别提高了15％和36％；当发酵温度提高到37℃时，乙醇产量提高了16％。在正常生长条件下或受乙醇胁迫时，FT9-11胞内积累了更多的海藻糖，这可能是FT9-11具有更高的多抗逆性的原因之一；FT9-11胞内过氧化氢酶及SOD的酶活比SC521的高，在受到H2O2的胁迫时，FT9-11的SOD酶活更高，胞内活性氧浓度比SC521低，这可使FT9-11细胞比SC521少受活性氧的伤害；另外，FT9-11的甘油代谢也与SC521不同。　　 筛选出一株高产乙醇的酵母菌株GEF369，经过形态观察及分子遗传鉴定，确定其为克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)。用基因组改组提高产乙醇酵母GEF369的乙酸耐受性。在优化其原生质体制备和再生条件后，对GEF369进行原生质体诱变，建立了一个提高了乙酸耐受性的正突变菌株库。以正突变菌株为出发菌株，经过四轮的基因组改组，筛选出一株耐酸性及其他耐受性提高的突变株S4-3。在含乙酸0.60％(v/v)的YNBX平板上培养时，GEF369已不能生长，S4-3菌株的生存率还能达到47.62％。S4-3对乙醇、冻融、H2O2及热冲击压力的耐受性分别是出发菌株GEF369的4.7、4.4、2.4和2.6倍。S4-3提高了乙醇发酵能力，发酵培养基中不含乙酸时，S4-3的乙醇产量、葡萄糖转化率分别比GEF369提高了5.26％、4.55％，发酵时间缩短了1h；在含0.40％、0.80％(v/v)乙酸时，S4-3的乙醇产量分别提高了5.44％、14.81％，葡萄糖转化率分别提高了5.16％、14.74％，发酵时间缩短了8h、30h。S4-3的DNA含量与其基因组改组的亲株含量相似，这表明在基因组改组过程中没有完全的染色体相加，可能只是发生由于同源重组引起的基因交换。突变株S4-3细胞膜具有更高的膜完整性及更高的胞内过氧化氢酶活性是其具有更强的乙酸耐受性的两个原因。这是基因组改组技术应用于非单倍体细胞的首次报道。　　 树状毕赤酵母(Pichia stipitis)具有发酵五、六碳糖产乙醇的能力。分别利用冻融循环、诱变结合冻融循环处理提高了Pichia stipitis PS163对糠醛和乙酸的耐受性，经过多轮筛选，得到两株糠醛和乙酸耐受性均得到明显提高的突变株UFT8-4及UFT8-10，在含0.35％(v/v)乙酸的YPX培养基中培养时，UFT8-4及UFT8-10的延滞期为20h，而PS163为32h。在含0.30％(v/v)糠醛的YPX培养基中培养时，UFT8-4及UFT8-10的延滞期分别为24h、28h，而PS163在34h以上；UFT8-10提高了木糖发酵乙醇的能力。在没有抑制剂的影响时，UFT8-10的乙醇产量提高了6.35％，发酵时间缩短了3h，乙醇发酵速率提高了25％；培养基中含有0.20％(v/v)糠醛时，UFT8-10的乙醇含量提高了13.33％，发酵速率提高了19.05％；培养基中存在0.20％(v/v)乙酸时，乙醇产量及发酵速率均提高了60％。在不含抑制剂的葡萄糖发酵培养基中，PS163与UFT8-10的发酵能力相似。在含有0.20％(v/v)糠醛的培养基中，UFT8-10的乙醇产量比PS163提高了16.67％，乙醇发酵速度提高了21.15％，发酵时间缩短了1h，但在含有0.20％(v/v)乙酸的培养基中，UFT8-10的乙醇产量下降了7.89％，发酵速度降低了10％，发酵时间也延长了1h。构建了一个对糠醛和乙酸耐受能力提高了的正突变菌株库。在冻融循环、诱变、诱变结合冻融循环几种育种方式中，紫外诱变结合冻融循环处理是提高P.stipitis糠醛和乙酸耐受性的有效方式，冻融处理循环8轮时可达到最佳效果。本研究还优化了PS163原生质体形成和再生的条件，确定了基因组改组的筛选方案。以正突变菌株库中的15株突变株为出发菌株，根据优化的基因组改组条件进行了一轮基因组改组，得到了提高糠醛抗性的突变株。