血吸虫病是一种严重危害人民健康的寄生虫病,血吸虫病的诊断是血吸虫病防治工作的基础。目前血吸虫病的诊断方法主要有病原学诊断和免疫学诊断。20世纪70年代以前,血吸虫病的诊断以病原学检查为主。随着血防工作的深入,患者经过反复的治疗,钉螺大面积被消灭,疫情大为减轻。由于病原学方法工作量大、对慢性病人和低度感染者检出率低,因此免疫学诊断方法的建立和改进多年来一直是血吸虫病诊断的研究热点。我国学者从50年代开始致力于免疫诊断方法的研究,当前国内免疫学诊断主要是循环抗体和循环抗原的检测。常用的抗体检测方法有间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,敏感性和特异性虽较好,但难以区分现症感染和既往感染,也无法考核疗效,不利于血吸虫病的监测。检测循环抗原可评估虫负荷数和活动性感染,具有较好的疗效考核价值,同时还可作为现症感染的依据。但目前循环抗原的检测存在着敏感性低、特异性不理想等问题。因此如何提高循环抗原检测的敏感性、特异性成为近年来研究的热点。鸡卵黄免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY)是鸡血液中的IgG被选择性转移到卵黄中形成的,而且是卵黄中的惟一免疫球蛋白类。IgY的结构与IgG相似,但在免疫诊断方面比哺乳动物源性的IgG更具优势。IgY的具有以下特点:(1)由于种系发生之间距离大,母鸡可对哺乳动物的抗原产生更强的免疫应答。(2)母鸡可以持续的产生高亲和力的抗体。20-30μg的高度保守的哺乳动物抗原可引起高效价的IgY长时间的分泌。(3)无损伤的抗体收集。只需收集免疫母鸡的鸡蛋即可获得IgY。(4)产量高。一只母鸡一年可产下约280只蛋,每只蛋含有100-150mg的IgY,这样每只鸡每年可生产28-42g的IgY。(5)不和类风湿因子结合。在检测中应用IgY可避免假阳性结果。(6)与补体不发生反应。哺乳动物的IgG可激活补体,导致假阴性的产生。IgY不和补体发生反应,在检测哺乳动物的血清时,可减少由补体造成的干扰。由于IgY抗体能提高免疫检测的敏感性、特异性,还具有产量大,性质稳定等优点,近年来,IgY在疾病的诊断方面得到广泛的应用,但在血吸虫病的免疫诊断中尚未见报道。因此,本实验拟制备抗循环抗原SEA的IgY抗体,探讨利用基于IgY的双抗体夹心ELISA法来检测病人血清中的循环抗原的可能性。本实验制备和鉴定了抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),并比较了两种提纯方法的效果。日本血吸虫SEA经静脉及皮下免疫25周龄的海兰母鸡4次,首次免疫剂量为60μg,加强免疫剂量为30μg,免疫间隔10天。分别用水稀释法和聚乙二醇法提取初次免疫后35d的IgY, BCA法测定其蛋白含量,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,比较其提纯效果。结果发现,每枚蛋经水稀释法提纯后可得到约61mg抗体,经聚乙二醇法提纯后可得到约57mgIgY。经SDS-PAGE分析,水稀释法纯化的完整的IgY有一条主要蛋白带,相对分子质量(Mr)为130 000;裂解后的IgY包含66 000和35 000的两条带和其它五条带;聚乙二醇法提纯的IgY主要包含一条66 000的主带和四条次带。由于两种方法提纯的抗体的纯度接近,而水稀释法具有经济简便,回收率高等优势,因此后续实验都采用水稀释法制备的抗体。免疫印迹(Western blotting)分析IgY抗体的特异性;建立双抗体夹心ELISA法,以IgY为捕获抗体,IgG为标记抗体,倍比稀释抗原SEA,检测纯化后IgY的敏感性;分别用水稀释法提取免疫后不同时间的卵黄抗体,观察抗体效价的变化。Western blotting的结果表明:IgY能识别结合SEA的3条蛋白条带:140 000、100 000、69 000。研究表明,SEA中的140 000与100 000蛋白分子是具有潜力的早期诊断靶抗原,说明了免疫后的IgY具有潜在的早期诊断价值。双抗体夹心ELISA结果显示,纯化后的IgY可检测到的SEA达2.4ng/ml,提示IgY具有较高的敏感性。母鸡初次免疫后第10天即有抗体产生,经加强免疫后,效价不断上升,至初次免疫后31天效价达1:1600。我们应用基于IgY抗体的双抗体夹心ELISA法检测了病人血清。以不同浓度的IgY作为捕获抗体,包被96孔酶标板,4℃过夜;用洗涤液PBS-T洗涤3次后,甩干,用1% BSA 200μl/每孔37℃封闭1h;同法洗完后,分别加病人血清和正常血清,100μl/每孔37℃温育1h ;洗涤、甩干后,以IgG为标记抗体,100μl/每孔37℃温育1h;洗完后,甩干,再加HRP标记的羊抗兔(浓度为1:100 000),37℃温育1h;同法洗涤、甩干,加底物OPD避光显色15min,2mol/L硫酸终止反应,在酶标仪上读取492nm处的吸光度值。结果表明,当IgY的浓度为2μg/ml,血清的稀释度为1:200时,S/N为2.7043,大于阳性判断标准2.1,效果最好。表明该法能够区分感染血清和正常血清,说明以IgY建立的双抗体夹心ELISA法可以用来检测血清中的循环抗原。本研究首次制备了抗日本血吸虫SEA的特异性IgY,具有产量大,提取方便,性质稳定等优点;免疫一次所用的SEA抗原仅为30μg,证明了只需少量抗原即可获得大量质量均一的IgY;同时将SEA稀释到2.4ng/ml时仍可被IgY检测出,说明IgY检测的敏感性较高;IgY的特异性研究表明,IgY能够识别有早期诊断功能的抗原分子,具有潜在的早期诊断价值。基于IgY的双抗体夹心ELISA法可以用来检测病人血清中的循环抗原。因此IgY在日本血吸虫病免疫诊断方面有着广阔的应用前景。