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第一部分:硼替佐米对卵巢去除小鼠骨质丢失的保护作用及其机制研究目的:蛋白酶体抑制剂类药物如硼替佐米(Bortezomib)临床上常作为抗肿瘤药物使用,其对体内各种酶活性的改变可能对骨代谢调节相关通路有相当的调节作用,但作为治疗骨质疏松药物尚缺乏研究证实。本研究部分,我们通过向去除卵巢小鼠的腹腔内注射硼替佐米,探究硼替佐米对去卵巢小鼠骨质丢失的保护作用。方法:动物实验分组设置为(1)假手术组(SHAM);(2)去卵巢骨量丢失组(OVX);(3)去卵巢骨量丢失+硼替佐米治疗(OVX+Bzb)组,每组7只(n=7)。假手术组仅做卵巢周围组织切除,另外2组小鼠行卵巢切除术。术后第21天开始,OVX组每周两次注射2%DMSO溶剂,OVX+Bzb组每周两次腹腔注射溶解于2%DMSO溶液的硼替佐米(Bortezomib),硼替佐米剂量标准为0.5mg/kg,为期4周。4周后将小鼠统一处死,取出双侧股骨,股骨经多聚甲醛固定5天后,将小鼠按组别全数行股骨Micro-CT检查并行骨结构参数分析,切片制成后后行HE、TRAP、免疫组织化学染色,检测股骨干骺端骨小梁及其周围破骨细胞数目变化,以及Smurf1和Smurf2的表达情况。结果:在体内实验结果中,我们可以观察到,经过去卵巢手术的小鼠的骨质丢失较假手术组明显。腹腔注射硼替佐米后能够有效减轻卵巢切除术后小鼠的骨量丢失。表现为Micro-CT结果骨结构参数与HE染色小鼠股骨干骺端骨小梁数目降低以及TRAP染色股骨干骺端骨小梁处阳性数目增多等情况被硼替佐米逆转。而OVX+Bzb组较OVX组中股骨免疫组化结果显示Smurf1、Smurf2蛋白表达下降。结论:应用硼替佐米处理可以减轻小鼠去卵巢后的骨质丢失,并抑制卵巢切除术后小鼠体内的破骨细胞形成。第二部分硼替佐米在体外对成骨细胞的分化的影响及其相关机制目的:硼替佐米治疗骨质疏松症的机制需要更多的体外成骨方向的研究来证实。本部分研究,我们通过体外实验,探究硼替佐米对成骨细胞分化的影响及其可能的相关的分子机制。方法:成骨细胞相关实验采用MC3T3-E1细胞,实验分组设置为(1)空白对照组(Control);(2)成骨诱导组(Osteogenic);(3)成骨诱导+硼替佐米干预组(Bortezomib),经过诱导后,通过成骨相关染色及定量法如碱性磷酸酶染色及活力测定来判断成骨细胞分化情况。并应用RT-PCR与Western-blot技术检测成骨细胞分化相关基因及蛋白Runx2、COL-I以及Smad泛素化调节因子Smurf1/2和BMP/SMADs信号通路相关蛋白Smad1/5/8的表达。结果:在体外实验结果中,成骨分化方面,硼替佐米可以促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化,表现为药物干预组中碱性磷酸酶(ALP)染色阳性数量与ALP活力测定结果较单纯成骨诱导组多,且茜素红S染色钙结节数量明显多于成骨诱导组。RT-PCR表明药物干预组COL-I、ALP、Runx2转录水平较骨诱导组高,Smurf1、Smurf2蛋白转录水平低,Western-Blot实验表明药物干预组Smurf1、Smurf2蛋白较诱导组表达减少,Runx2,Smad1/5/8,OPG蛋白表达增多。结论:硼替佐米可能通过抑制Smurf1、Smurf2蛋白,活化BMP/Smads信号通路,促进成骨相关基因及蛋白表达。第三部分硼替佐米在体外对破骨细胞的分化影响及其相关机制目的:硼替佐米治疗骨质疏松症的机制需要更多的体外破骨方向的研究来证实。本部分研究,我们通过体外实验,探究硼替佐米对破骨细胞分化的影响及其可能的相关分子机制。方法:破骨相关实验所用的细胞采用从C57BL/6小鼠骨髓中提取的单核巨噬细胞(BMMCs),实验分组设置为(1)空白对照组(Control);(2)RANKL诱导组(RANKL);(3)RANKL诱导+硼替佐米干预组(RANKL+Bzb);其中每组中均加入M-CSF。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色来比较不同组别之间破骨细胞形成数量,并通过破骨细胞肌动蛋白环染色(F-actin ring)来观察硼替佐米是否有抑制破骨细胞肌动蛋白环形成的功能。将相同数量的BMMCs细胞接种到羟基磷灰石骨板后并按前实验分组处理,通过吸收孔面积及数量差异,来观察破骨细胞的骨吸收功能能否被抑制。结果:破骨分化方面,实验结果表明硼替佐米可以抑制骨髓单核巨噬细胞;BMMCs分化成破骨细胞的数量,其具体表现为TRAP染色中RANKL+Bzb组中的破骨细胞形成数量较RANKL组减少,F-actin环形成实验中证实硼替佐米可抑制破骨细胞肌动蛋白环形成。RANKL+Bzb组羟基磷灰石骨板上的破骨细胞对骨板的吸收面积远低于RANKL组。Western-Blot实验表明药物干预组较诱导组TRAP,NFATC1,MMP-9,CatheosinK(CTSK)蛋白表达减少。结论:硼替佐米抑制BMMCs向破骨细胞分化,下调破骨相关基因及蛋白的表达,抑制破骨细胞形成。