核糖核酸酶H （RNase H）能够特异地水解RNA/DNA杂合双链或DNA-RNA-DNA/DNA嵌合型底物中的RNA。根据氨基酸序列及空间结构相似性，RNase H分为两类，1型和2型。其中，1型RNaseH包括细菌的RNase HI及真核生物的RNase H1；2型RNase H包括细菌RNase HII、RNase HIII、古细菌RNase HII和真核生物RNase H2。RNase HII/H2广泛存在于各种生物体内，但RNase HI/H1和HIII只存留在部分生物体内。目前人们普遍接受的看法是，RNase HI/H1和HIII只能切割含有四个（或更多）核糖核苷酸的DNA-（rN）n-DNA/DNA双链（n≥4）或RNA/DNA杂合链底物，而RNase HII/H2不仅可以切这些底物，还能切割DNA-rN₁-DNA/DNA（rN₁，单个核糖核苷酸）双链。基因组全序列分析表明，肺炎衣原体没有RNase HI，只有两个2型的RNase H：CpRNase HII和CpRNase HIII，分别由CP0654和CP0782（NCBI序列号）基因编码。我们前期的体外生化研究证实纯化后的CpRNase HII蛋白能切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物；而CpRNase HIII可以切RNA/DNA底物。本研究发现CpRNase HIII在锰离子(Mn²⁺)存在时也能切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物。这是RNase H领域中首次报道RNase HIII具有切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物的能力。体外生化实验证实，两种CpRNase H切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物时对金属离子的依赖性不同，CpRNase HIII依赖Mn²⁺，而CpRNase HII则偏爱镁离子（Mg2+）且活性会受到Mn²⁺抑制。进一步研究表明，在切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物时，两种酶对反应体系中的镁锰离子波动敏感。另一方面，两种CpRNase H切割其它底物（RNA/DNA杂合链及类似冈崎片段的底物）时酶活性并不会因为镁锰离子波动受到明显影响。这些结果表明镁锰离子水平的变化会抑制一种CpRNase H切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物的活性但同时激活另一种CpRNase H的活性。在细菌体内，我们也证实了上述体外实验的结果。采用基因重组技术构建了三株大肠杆菌rnh突变株，基因改造情况为：LZ1[DY329,ΔrnhA ΔrnhB:: CprnhB]，LZ2[DY329, ΔrnhA:: CprnhC ΔrnhB::CprnhB]，LZ3[DY329, ΔrnhA:: CprnhC ΔrnhB]。其中，CprnhB和CprnhC分别代表两种CpRNase H （HII和HIII）的编码基因；rnhA和rnhB分别表示大肠杆菌RNase HI和HII的编码基因。CpRNase HII遗传互补大肠杆菌RNase H缺失依赖于Mg2+，但培养基中添加0.2mM Mn²⁺抑制了CpRNase HII的该功能，导致细菌生长缓慢；相反，CpRNase HIII弥补大肠杆菌RNase H缺失则依赖于Mn²⁺。对大肠杆菌突变株的基因组进行碱敏感性分析发现，当CpRNase H活性受到抑制而导致细菌生长迟缓时，其基因组对碱非常敏感，表明此时基因组中掺入了大量核糖核苷酸。考虑到体外实验证实CpRNase H酶切RNA/DNA杂合链、类似冈崎片段的底物时不受缓冲液中镁锰离子波动的影响，突变株生长迟缓的主因是体内CpRNase H切割DNA-rN₁-DNA/DNA底物的活性受到抑制，导致基因组中掺入了过多的单个核糖核苷酸；而在生长培养基内添加对应喜好的金属离子则会恢复CpRNase H的活性从而使突变株恢复正常生长。培养基内添加锰离子影响了细菌体内CpRNase H的活性，这个结果暗示培养基内添加锰时细菌胞内的锰浓度发生了变化，我们提供了相关数据证实这一点。采用含有或不含锰的培养基培养这三株大肠杆菌突变株，用等离子发射光谱（ICP-AES）测定细菌胞内锰离子浓度。结果表明含锰培养基培养的细菌相比不含锰培养基培养的，其胞内锰离子浓度增加了5¹4倍，对胞内RNase H活性产生了明显影响，即促进CpRNase HIII活性、抑制CpRNase HII活性。另外，为了验证培养基中添加的锰是否会影响CpRNase H编码基因的表达，我们选择在有锰和无锰时生长有差异的突变株并提取其总RNA进行实时定量PCR。采用管家基因gapA作为内参基因做相对定量分析，结果证实基因表达并未因培养基中添加或缺少锰而有明显差异，表明培养基中的锰影响突变株生长是因为CpRNase H的活性受到抑制，而不是CpRNase H编码基因的表达受阻。这些实验结果表明，两种CpRNase H在体内是合作互助的关系：在正常情况下由CpRNase HII执行功能，去除基因组中掺入的单个核糖核苷酸；而在离子波动的情况下，比如锰含量较高时，CpRNase HII的活性受到抑制而由CpRNase HIII行使同样的功能。肺炎衣原体采用了两种2型RNase H很可能是因为自身生存环境复杂，在复杂多变的外界环境中两种CpRNase H能够合作、互补，从而使细胞可以维持正常生理代谢。在证实CpRNase HIII也具有酶切DNA-rN₁-DNA/DNA底物的活性之后，我们进一步研究了CpRNase HIII识别、切割这类底物的结构基础。通过体外生化测活，鉴定突变的氨基酸对该蛋白切割、识别底物的重要性；结合同源模建、分子对接及分子动力学模拟等计算机辅助的方法，阐明了CpRNase HIII识别DNA-rN₁-DNA/DNA底物的机制。CpRNase HIII的“GKG”基序负责识别单个核糖核苷酸，识别方式与RNase HII中“GR （K） G”基序相似，表明CpRNase HIII采纳了与HII相似的底物识别机制。RNase HII/H2识别核糖核苷酸还需要一个高度保守的酪氨酸（Y），但通过分析氨基酸序列及同源模建得到的蛋白结构模型，发现在CpRNase HIII对应位置上没有这样一个Y残基，通过分子动力学模拟我们发现CpRNase HIII的第94位的丝氨酸（Ser94）与DNA-rN₁-DNA/DNA底物中嵌合的单个核糖核苷酸3′-端的脱氧核糖核苷酸形成稳定氢键，将该脱氧核糖核苷酸拖拽地偏离了核糖核苷酸，同时使DNA双螺旋的局部构象发生了变动。这个举动似乎执行了RNase HII中酪氨酸的功能，援助“GKG”基序准确地识别核糖核苷酸的2′-OH。在分子模拟结果的指导下，我们围绕Ser94进行了一系列生化实验，证明了该Ser对酶活性的重要性。这部分研究结果阐释了CpRNase HIII的底物识别机制。