【摘 要】
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UDP-葡萄糖4-差向异构酶（UDP-galactose 4-epimerase,GALE,EC 5.1.3.2）是灵芝多糖合成途径中糖供体合成的重要酶,它参与UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖的相互转化,与多糖中半乳糖残基含量密切相关。本文对来源于灵芝的GALE基因进行异源表达,进而解析其酶学性质和催化特征。同时,通过构建灵芝GALE过表达重组菌株,分析其液态发酵过程中多糖产量、单糖组成等性质的变化
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UDP-葡萄糖4-差向异构酶（UDP-galactose 4-epimerase,GALE,EC 5.1.3.2）是灵芝多糖合成途径中糖供体合成的重要酶,它参与UDP-葡萄糖与UDP-半乳糖的相互转化,与多糖中半乳糖残基含量密切相关。本文对来源于灵芝的GALE基因进行异源表达,进而解析其酶学性质和催化特征。同时,通过构建灵芝GALE过表达重组菌株,分析其液态发酵过程中多糖产量、单糖组成等性质的变化,探究GALE对灵芝多糖合成的影响规律。主要研究内容及结果如下:（1）克隆得到灵芝CGMCC5.26菌株编码UDP-葡萄糖4-差向异构酶的基因片段,导入大肠杆菌异源表达后进行酶学性质、底物转化率等方面的分析。酶学性质研究表明重组酶最适反应p H为6,在p H 7-9范围内有较好的稳定性;最适反应温度为30℃,温度在40℃时稳定性最好;低浓度的Fe2+和Mg2+对GALE有激活作用;以UDP-葡萄糖为底物时,Km为0.824 mmol·L-1,kcat为1.333 s-1;该酶对游离单糖表现出催化活性,可催化D-葡萄糖、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺;最佳反应条件p H 8.0、温度30℃,添加0.05 mmol·L-1 Fe2+,底物与酶浓度比为1.8时UDP-葡萄糖的转化率从16.0%升至39.4%。（2）构建灵芝过表达的重组质粒exp-GL30389-e GFP,使用聚乙二醇（PEG）转化法将过表达质粒转化至灵芝原生质体,通过潮霉素筛选得到转化子;q RT-PCR结果显示转化菌株T9、T20、T24中目的基因的转录水平明显提升,分别提高了分别提高了7.68倍、2.02倍、2.42倍;转化子在激光共聚焦显微镜下观察检测到e GFP荧光信号。以上结果表明过表达质粒成功转入灵芝的原生质体,且融合蛋白GL30389-e GFP在菌丝体内成功表达。（3）将上述三株灵芝过表达菌株与野生型菌株进行液体发酵,探究过表达GALE对灵芝多糖发酵的影响,结果显示过表达菌株的最大生物量和碳源消耗速率明显低于野生型。三株过表达菌株的最大胞外多糖（EPS）产量均高于野生型,其中T20、T24的胞外多糖产量分别提高了9.9%和19.6%;T9的最大胞内多糖含量（IPS）相比野生型提高了59.8%。胞外多糖、胞内多糖组分中的半乳糖和甘露糖的比例增加,葡萄糖的比例减少。菌体形态方面,过表达菌株形状更为规则,趋于圆球状,菌体表面粗糙度更低。在不同的发酵过程中,过表达菌株的平均当量直径都小于野生型菌株的平均当量直径,且S和M型菌球比例较野生型更高。
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