病态窦房结、严重房室阻滞等心律失常是影响人类健康的心血管疾病之一，随着细胞治疗、基因治疗以及组织工程技术的发展，生物起搏器已成为心脏起搏研究的热点。目前，构建生物心脏起搏器的方法主要有三种：利用基因转染的方法调节自体心肌细胞离子电流触发起搏；向受体心脏种植起搏细胞或工程化的起搏细胞；利用组织工程技术构建组织工程化起搏组织。组织工程化窦房结是指选取适当的起搏细胞和支架材料，在体外应用组织工程的方法构建功能稳定的组织工程化起搏组织。组织工程化窦房结的形态结构更接近生理状态窦房结，细胞在三维支架上更易生长、不易分散，能够形成统一节律搏动。本实验室前期已经在体外成功构建了组织工程化窦房结，并证实该窦房结具有较好的起搏活性、体内移植出现异位起搏点。组织工程化组织或器官的存活需要血管提供氧气、营养物质，并带走代谢产物，且血管内皮细胞对组织的成熟和分化也有一定的影响。未进行血管化构建的组织工程化组织或器官，移植体内后的存活必须依赖宿主的血管长入，但是，大多数宿主血管长入的速度都不能满足有一定体积的移植体的需求，特别是在植入的早期。因此，决定三维的组织工程化组织或器官移植成功的关键是能否有效、快速的形成功能血管。目前，组织工程组织或器官血管化的方法主要有三种：体内血管预构建；利用血管生成因子促进血管发生，和血管的体外预构。目前，组织工程化窦房结血管化的研究尚未见报道。基于以上观点，本实验拟在我们前期组织工程化窦房结构建的研究基础上，选用同种异体胚胎源性起搏样细胞与骨髓源性内皮祖细胞联合种植，进行血管化组织工程化窦房结的体外构建和体内移植，通过形态学、免疫组织化学、Western Blot等方法探讨血管化组织工程化窦房结构建心脏生物起搏器的可行性及其可能机制，以进一步探讨组织工化窦房结移植构建心脏生物起搏器的可行性，并确定一种可行的血管化组织工程化窦房结的构建方法。第一部分胚胎心脏祖细胞的分离、培养、诱导及鉴定研究目的：获取具有生理功能的大鼠胚胎源性起搏样细胞。材料和方法：分离受孕11.5天的SD大鼠胚胎心管，采用胰酶消化的方法接种培养心脏祖细胞。培养1周，用内皮素-1诱导培养3天。观察诱导后细胞的搏动情况和细胞形态，取生长状态良好的细胞用免疫细胞荧光化学法检测起搏细胞特异性标志物HCN2、HCN4、α-actin、TnT及Cx43的表达情况，进行细胞鉴定。结果：培养的大鼠胚胎心脏祖细胞贴壁生长，呈梭形、三角形，细胞自发搏动。内皮素-1诱导后，可见诱导后起搏样细胞生长密集、成簇生长、部分区域可出现成团搏动。免疫细胞荧光化学检测显示，起搏细胞特异性标志物HCN2、HCN4、Cx43、α-actin和TnT均为阳性表达，阳性细胞率达90%以上。结论：内皮素-1诱导，可以获得具有生理功能的胚胎源性起搏样细胞。第二部分骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养及鉴定研究目的：获取活性好、纯度高的骨髓源性内皮祖细胞。材料和方法：分离成年SD大鼠双侧股骨、胫骨骨髓，等量淋巴细胞分层液分离，收集单个核细胞，通过EGM-2MV条件培养基进行骨髓源性内皮祖细胞的培养。观察诱导培养后细胞的形态，取生长状态良好的细胞用免疫细胞化学的方法检测内皮祖细胞表面标志物CD31、CD34和CD133的表达，进行细胞鉴定。结果：大鼠骨髓源性内皮祖细胞贴壁生长，多数细胞呈梭形、三角形、纺锤形或不规则形。5-7天，EPCs细胞集落出现，中间为圆形细胞群，边缘细胞为梭形、出芽，呈单层生长，类似血岛；9-11天，细胞出现“铺路石样”结构；呈现EPCs典型形态特征。免疫细胞化学法检测显示，表面标志物CD31、CD34和CD133阳性表达，阳性细胞达90%以上。结论：等量淋巴细胞分层液分离、EGM-2MV条件培养基培养，可以获得活性好、纯度高的大鼠骨髓源性内皮祖细胞。第三部分血管化组织工程化窦房结的体外构建研究目的：体外构建血管化组织工程化窦房结。材料和方法：选择Matrigel基质胶为支架材料，将标记后的骨髓源性内皮祖细胞与胚胎源性起搏样细胞以不同的比例（2:1/1:1/1:2）与液态Matrigel基质胶混合，在37℃、5%CO2培养箱内进行体外共培养。分别在18h、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d、17d、19d、21d观察不同实验组细胞复合体的形态及搏动频率，免疫荧光显微镜下和苏木精-伊红染色方法观察两种细胞的分布情况。结果：胚胎源性起搏样细胞与骨髓源性EPS细胞2:1和1:1混合组培养18h出现内皮细胞典型的“成血管现象”；1:2混合组“成血管现象”不明显。1:1和1:2混合组培养第3天，复合体大部分区域开始出现统一的搏动，且随着培养时间的延长，频率逐渐增加，培养到2周左右时频率达到最高峰；但培养至3周左右时Matrigel基质胶体积较前减小，自发搏动较前减弱。2:1混合组统一搏动不明显。免疫荧光显微镜下观察和苏木精-伊红染色结果显示，1:1混合组两种细胞密度分布相对均匀，细胞间连接广泛存在。结论：以骨髓源性内皮祖细胞与胚胎源性起搏样细胞联合种植，可以构建血管化组织工程化窦房结；两种细胞以1:1的比例效果较好。第四部分血管化组织工程化窦房结的在体研究研究目的：血管化组织工程化窦房结体内移植，观察移植体功能发挥、局部血流变化，和VEGFR-2、PI3K、AKT等因子的表达情况。材料和方法：健康成年SD大鼠60只，雌雄不限，体重200-250g，随机分为3组，每组20只。正常对照组大鼠不做任何处理，非血管化组织工程化窦房结组将体外构建的组织工程化窦房结移植入大鼠心脏的左室壁心外膜下，血管化组织工程化窦房结组将体外构建的血管化组织工程化窦房结移植入大鼠心脏的左室壁心外膜下。定期监测各组大鼠心电图情况；术后4周、8周，激光多普勒血流仪在体测定左室壁血流量；HE染色观测移植组织血管形成； Western Blot方法检测移植区域VEGFR-2、PI3K、AKT等因子的表达情况。结果：非血管化组织工程化窦房结组和血管化组织工程化窦房结组出现异位起搏的室性早搏。术后4周，血管化组织工程化窦房结组移植局部血流量高于正常对照组，非血管化组织工程化窦房结组低于正常对照组；术后8周，三组心室壁血流量无差异。术后4周，血管化组织工程化窦房结中有大量新生血管形成，非血管化组织工程化窦房结组新生血管较少；术后8周，血管化组织工程化窦房结组和非血管化组织工程化窦房结组中新生血管情况无差别。术后4周血管化组织工程化窦房结组中VEGFR-2、PI3K、AKT等因子在移植区域的表达水平高于非血管化组织工程化窦房结组和正常对照组；术后8周，三种因子的表达在3个实验组中无差异。结论：用本实验方法构建的血管化组织工程化窦房结植入体内可长期存活，产生异位起搏点；血管化组织工程化窦房结可较早期建立血液供应；发生血管化的机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。