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磷脂酶D(PLD,EC 3.1.4.4)能够在磷脂分子中引入功能性极性头,而受到广泛关注。PLD在医药和食品工业具有很大的应用前景,可用于合成不同功能的生物活性磷脂,例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰鲨肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂类似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰丝氨醇。尽管Streptoverticillium cinnamoneum来源的PLD已经成功地在重组Streptomyces livians中大量表达,产量达到5.5×104 U·L-1(118 mg·L-1),但来源不足和价格高仍然阻碍了 PLD酶法制备功能性磷脂的广泛应用。此外,在大肠杆菌和毕赤酵母中大量生产链霉菌PLD仍然困难,归因于它对宿主高的细胞毒性,引起严重的细胞裂解,这可能是PLD降解宿主细胞膜上磷脂而造成的。本文首先采用类似于链霉菌分泌表达PLD的方式,尝试在毕赤酵母、短小芽孢杆菌和大肠杆菌系统中胞外生产链霉菌PLD,以筛选一种合适的异源表达系统。在毕赤酵母中,尽管细胞培养pH与PLD最适pH相偏离和低温诱导的策略促进PLD分泌,但酶活很低,只有0.08 U·mL-1。在短小芽孢杆菌中,采用较弱的启动子P5,成功实现在Brevibacillus choshinensis SP3分泌表达PLD,酶活达0.88U·mL-1。在大肠杆菌系统中,与PLD融合PelB信号肽表达在周质空间比较,PLD融合协运蛋白Yebf并不能促进分泌,而共表达细胞溶解蛋白Kil,略微促进胞外的酶活。PLD融合细菌表面抗原43(Ag43)展示在大肠杆菌细胞表面,显示全细胞酶活达1.3 U·mL-1。在启动子相同情况下(PT7),这四种融合表达比产率相近,其中PLD表达在周质空间的方式略高。基于上述表达系统的PLD产量和比产率,最终选择大肠杆菌周质空间表达PLD的系统,进行下一步研究工作。在大肠杆菌周质空间表达PLD的过程中,PLD对宿主的细胞毒性会引起质粒不稳定、PLD合成时间较短、细胞裂解和酶泄露。为了解决这些问题,本文整合优化了 PLD生产的上游处理过程。有效的策略包括在质粒中插入来源pSC101的par区域,同时使用大肠杆菌recA-突变株保持质粒的稳定;使用中等强度严紧调控的阿拉伯糖启动子PBAD;优化密码子和氨基酸补充;通过补充营养保持最佳的细胞状态,并低温饱和诱导表达(18 ℃)。通过这些策略,PLD表达质粒在菌株中保持100%稳定性;在分批培养中,获得大量位于周质的重组PLD表达,产量达1.2×105U·L-1(81.5mg·L-1),占总酶活的99.5%。同时,相较于文献报道的情况,在诱导2-3 h后,几乎所有重组菌被杀死,本实验中伴随甘油消耗,PLD合成时间延长至9h。再者,考虑到超过90%表达的PLD保持在大肠杆菌周质空间中,本文发展了一种简单、有效的提取方法。使用1 0 mM EDTA、0.05%(w/v)脱氧胆酸钠(DOC)和200 mM Tris-HCl(pH 7.5)的提取液,能够100%释放周质空间的PLD,同时得到合适的比活力。此外,优化提取体积和提取时间,显示采用18-20mL·g-1细胞湿重体积(WCW)的提取液,萃取30-40min,提取PLD足够有效。随后,通过使用EDTA和DOC法提取、硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和Ni2+亲和层析四步下游处理,完成大规模纯化PLD,结果PLD被纯化327倍,比活力达到1471.5 U·mg-1。SDS-PAGE和Western Blotting分析显示重组PLD分子量大小与预想的一致。最后,从细菌交叉保护的观点出发,本文考察了还原剂、醇、核糖体抗生素、盐和多元醇引起的多种细胞压力对PLD表达和细胞生长的影响。结果表明,模仿冷休克反应的四环素和渗透剂(盐和多元醇)促进PLD的表达,特别是高氯化钠压力(0.4-0.5M),极大地促进PLD的表达(增加4倍),同时缓解PLD表达造成的细胞生长抑制。这个现象也发生在加入氯化钾和氯化锂,但不出现在提供同等渗透压力的山梨醇或甘露醇。这表明这种现象取决于特异性的碱金属离子,而不是渗透压。最终,在3 L发酵罐分批培养中,0.4 M氯化钠胁迫极大地促进PLD 的生产,产量达1.1×106U·L-1(748 mg·L-1),而胞外活力为 1.6×104U·L-1,占总酶活的1.5%。获得的PLD酶活产量是文献中大肠杆菌产量的90倍,是之前Streptomyces lividans产量的20倍。同时,PLD表达耦合细胞生长和甘油消耗,由此PLD合成时间延长至36 h。尽管随后的细胞衰亡期持续至34 h,但胞外活力仅有5.0×104U·L-1,占总酶活的4.8%。因此严重的细胞裂解和酶泄露并没有发生。总之,本文成功规避了 PLD对大肠杆菌的细胞毒性,解决了质粒不稳定、PLD合成时间短、细胞裂解和酶泄露的问题,成功实现了 PLD的大量表达,同时优化了下游分离纯化过程,为PLD酶法加工在制药和食品工业上广泛应用奠定了坚实的基础。