研究背景垂体瘤是常见的颅内肿瘤,临床中约25%的原发性脑肿瘤为垂体瘤,目前主要的治疗手段是手术治疗、放射治疗和药物治疗。然而三种治疗手段均有一定的局限性：放疗能阻止部分垂体瘤生长,但是起效较慢；侵袭性生长的垂体瘤因侵犯到周围组织,手术较难全部清除；药物治疗目前主要针对生长激素腺瘤和泌乳素腺瘤,对于促肾上腺皮质激素腺瘤等类型垂体瘤治疗效果差。因此,新的治疗药物亟待发现。能够阻断异常活化信号通路进而抑制肿瘤生长的分子靶向药物是当前研究热点。近年来研究发现,垂体瘤的发生发展与PI3K/AKT/mTOR信号传导通路有着密切的关系,在垂体瘤中该信号通路常常处于高度的激活状态,因此可作为垂体瘤的潜在治疗靶点,PI3K/AKT/mTOR信号通路得到了研究者们的广泛关注。作为丝/苏氨酸蛋白激酶的一种,mTOR是一个对PI3K/AKT/mTOR信号通路起关键节点作用的效应蛋白。活化后的mTOR可磷酸化下游效应物p70S6K和4E-BP1,进而控制和影响着核糖体合成和mRNA翻译等重要的细胞功能,达到促进细胞的生长和增殖。依维莫司是雷帕霉素(Rapamycin)的衍生物,能特异性抑制mTOR的功能,阻滞细胞周期,进而发挥抗肿瘤的生物学效应,目前在肿瘤的临床治疗已得到应用。多项实验研究提示mTOR抑制剂依维莫(Everolimus)对人原代培养的垂体瘤细胞以及鼠来源的垂体瘤细胞系均有一定抑制作用,但是由于负反馈调节存在于mTOR信号通路,因此常造成垂体瘤细胞对依维莫司等mTOR抑制剂的耐药性产生。在肿瘤治疗中,限制抗肿瘤药物发挥作用的的常见原因之一是耐药作用。研究发现,肿瘤对依维莫司耐药是因为在PI3K/AKT/mTOR信号通路中存在负反馈调节,依维莫司下调mTOR及其下游信号p70 S6K的磷酸化水平的同时会造成p-AKT水平的升高。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor-alpha, PDGFR)是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白,能够促进细胞的分裂与增殖,与肿瘤的发生发展关系密切。PDGFR主要包含两个受体亚型PDGFR-α和PDGFR-β,在AtT-20细胞中仅PDGFR-α的mRNA表达。PDGFR-α在肿瘤生长、增殖过程中起重要作用,其特异性抑制剂格列卫(Glivec)已成功应用于临床。针对人垂体瘤的研究发现,44%的垂体瘤组织中表达PDGFR-α,在垂体腺瘤中表达率更高达62%。PDGFR-α可通过P3K/AKT/mTOR和RAF/ERK等不同的信号途径把促有丝分裂的信号向胞内传递,从而调控细胞的分裂以及生长和增殖。PDGFR信号通路与mTOR信号通路关系密切,两者在通路上存在交叉点。已有研究表明,应用PDGFR-α抑制剂格列卫可以有效地降低AKT的磷酸化水平。研究显示,格列卫联合依维莫司在治疗胃癌、白血病等肿瘤中均取得较好的协同作用,而在垂体瘤的治疗中未见相关报道。本研究初步探讨格列卫和依维莫司在小鼠垂体瘤细胞AtT-20中联合作用的效果及可能的分子作用机制,为垂体瘤的联合靶向治疗提供参考。研究方法1、主要试剂与仪器格列卫和依维莫司为诺华公司惠赠；AtT-20细胞株购于中国科学院上海细胞所,为悬浮培养细胞；胎牛血清购于Gibco公司；RPMI-1640培养液和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)购自美国Hyclone公司；CO2培养箱购自日本三洋公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；酶标仪与PCR仪购于美国Thermo Fisher公司；TRIZOL试剂购于美国Invitrogen公司；PCR用引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成；Real-time PCR试剂盒购自TAKARA公司；一抗AKT与p-AKT、ERK与p-ERK、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗购于Cell Signaling公司；The ChemiDoc MP成像仪、电泳槽和转膜仪购于Bio-Rad公司。2、细胞培养用含100U·mL-1青霉素与100U·mL-1链霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在5%C02、37℃培养箱中培养。每3天离心收集后传代培养,所有实验均采用对数生长期细胞。3、CCK-8检测细胞增值率及联合指数实验分6组。溶剂对照组；空白对照组；阴性对照组；格列卫处理组(G5、 G10、G15、G20、G25μM);依维莫司处理组(E0.1、E1、E10、E100、E200nM);联合用药组(E1+G15、E10+G15、E10+G20);取对数生长期的细胞按1×105个/孔接种于96孔细胞培养板中,不同浓度的依维莫司和格列卫按分组设计依次加入,单独用药处理24、48、72h,联合用药处理72h。每孔加入10%CCK-8于37℃培养4h后置酶联免疫检测仪上测定各孔在波长490nm处的吸光度(A)值。每组设平行孔3个,实验重复进行3次。计算细胞增殖率：细胞增殖率(%)=(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白孔吸光度)×100%。计算联合指数(Combination Index, CI)使用Chou-Talalay公式：CI=CA,X/ICX,A+CB,X/ICX,B (CA,X, CB,X分别是联合用药达到X%的药效时,药物A和药物B的浓度；ICX,A’ICX,B分别是单独用药达到相同的药效时,药物A和药物B的浓度),CI等于1表明两药之间以相加的方式相互作用,CI小于1表明两药之间以协同的方式相互作用,CI大于1表明两药之间以拮抗的方式相互作用。4、实时荧光定量PCR检测AKT、ERK的mRNA表达实验分4组。阴性对照组；格列卫处理组(G20gM)；依维莫司处理组(E1nM);联合用药组(ElnM+G20μM)。药物处理48h后分别离心收集以上各组细胞,采用TRIZOL法提取总RNA,分光光度仪测RNA纯度及浓度,取1μg总RNA进行逆转录得cDNA,按照Real-time PCR试剂盒加样说明配制反应体系进行实时荧光定量PCR。q-PCR反应条件：95℃ 30s,95℃ 5s,60℃ 30s,72℃ 30s,共45个循环；溶解曲线95℃ 15s,60℃ 60s,95℃ 30s,60℃ 15s。各基因的相对表达量按2-ΔΔCt法计算。5、Western blot检测AKT和p-AKT、ERK和p-ERK蛋白的表达实验分4组。阴性对照组；格列卫处理组(G20μM)；依维莫司处理组(E1nM);联合用药组(E1nM+G20μM)。药物处理48h后分别离心收集以上各组细胞,加入细胞裂解液100μ1(RIPA 89μl+PMSF 1μl+PhosSTOP 10μl)提取细胞总蛋白,采用BCA(bicinchonimic acid)法测定蛋白浓度,加入上样缓冲液,置于沸水(95～100℃)7min使蛋白变性,取50gg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离蛋白,用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜,按目的蛋白分子量切膜,5%脱脂奶粉封闭2h,分别加入p-AKT、p-ERK等一抗抗体(1：1000)置于4℃孵育过夜,TBST洗涤10min×3次,分别加入相应的二抗(1：2000)置于室温孵育lh,TBST洗涤10min×3次,加入新配制显影液,最后置于成像仪进行显影拍照记录,并进行灰度值分析。6、统计分析实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,所有数据以均数±标准差(X±S)表示,多组间比较使用单因素方差分析,采用LSD和SNK法,方差不齐时采用多重比较的Dunnett’s T3方法,两组间比较选择t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、单独和联合用药对AtT-20细胞增殖影响实验所用依维莫司和格列卫均使用DMSO(终浓度始终小于0.25%)作为溶剂,因此以0.25%浓度的DMSO作为溶剂对照组。结果显示,与阴性对照组比较差异没有统计学意义(P>0.05),排除DMSO对肿瘤细胞增殖的影响。单独应用格列卫和依维莫司对小鼠垂体瘤细胞AtT-20增殖均有抑制作用,并呈时间依赖性和剂量依赖性。ART-20细胞对依维莫司敏感性较差,其增值率均高于50%；格列卫对AtT-20细胞抑制作用强,最低增值率低于20%。根据单独作用时两种药物对AtT-20增值率的影响选择联合用药的浓度,1和10nM的依维莫司与15和20gM的格列卫联合,分别组成E1+G15、E10+G15、 E10+G20三种联合方案,处理细胞72h。依据Chou-Talalay公式计算发现不同联合用药方案的CI值均大于1,表明格列卫与依维莫司联合用药表现为拮抗作用。2、单独和联合用药对AKT、ERK的mRNA表达影响单独与联合应用格列卫和依维莫司作用于AtT-20细胞48h后,q-PCR结果显示无论是单独用药还是联合用药,与阴性对照组之间两两比较AKT、ERK的mRNA表达量均未见明显变化,差异无统计学意义,P>0.05。3、单独和联合用药对AKT和p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达影响蛋白印迹实验检测结果显示,格列卫处理组、依维莫司处理组与联合用药组细胞中AKT、ERK总蛋白表达与阴性对照组比较表达量未见明显变化,差异无统计学意义,P>0.05；同阴性对照组比较,依维莫司处理组和格列卫处理组的p-AKT、p-ERK的表达均有不同程度上调,差异有统计学意义,P<0.05；联合用药时,p-AKT、p-ERK的表达水平高于依维莫司处理组和格列卫处理组,差异有统计学意义,P<0.05。联合用药可显著上调AKT、ER水的磷酸化水平,从而减弱了对细胞增值的抑制效果。结论1、格列卫和依维莫司单药对小鼠垂体瘤细胞AtT-20增殖均有抑制作用,并呈时间依赖性和剂量依赖性,联合用药则表现为拮抗作用。2、单独与联合应用格列卫和依维莫司对AtT-20细胞的AKT、ERK的mRNA表达量均无明显影响。3、单独与联合用药未影响AtT-20细胞的AKT、ERK总蛋白表达,但均可显著上调AKT、ERK的磷酸化水平,联合用药上调更明显,从而减弱了联合用药时对细胞增值的抑制效果。